D-甘露醇是一种天然的六碳糖醇,与山梨糖醇互为同分异构体,已被证明是抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体,被广泛应用在食品、医疗和化工行业。全细胞催化法是介于酶法和发酵法之间的一种催化技术,具有条件温和、副产物少、收率高等优势。甘露醇脱氢酶（Mannitol dehydrogenase,MDH）作为关键酶,可直接催化底物果糖转化为D-甘露醇,同时需要NADH的参与。本文基于多酶级联反应构建了一种高效合成D-甘露醇的全细胞催化体系,解决了辅因子NADH再生用酶的效率较低、多酶级联催化体系转化速率不平衡等问题,提供了一种绿色、高效生物催化生产D-甘露醇的方法,为实现其规模化生产奠定了基础,同时也对其他相关稀有糖醇的研究具有指导意义。（1）不同来源甘露醇脱氢酶的筛选。克隆表达了假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）来源的Lpmdh,肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）来源的Lmmdh,以及假单胞菌（Peptococcacea bacterium 1109）来源的Pbmdh。研究了三种来源甘露醇脱氢酶的酶学性质,Lp MDH和Lm MDH的最适反应温度为30℃,最适p H为6.5,Pb MDH的最适反应温度为60℃,最适p H为8.0,Lp MDH和Lm MDH耐酸性较Pb MDH强,适合弱酸性条件的生物转化。对比三者的D-果糖转化能力,在辅酶充足条件下,Lp MDH催化果糖生成D-甘露醇的效率最高,甘露醇的摩尔转化率达82.3%,综合三种来源MDH酶学性质及D-果糖转化能力的研究结果,确定Lp MDH为后续转化的关键酶。（2）辅酶循环体系的构建与筛选。分别克隆表达自于博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）的甲酸脱氢酶基因Cbfdh和来自解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyleliquefaciens DSM7）的葡萄糖脱氢酶基因Bagdh。比较添加Ba GDH和Cb FDH对辅酶循环体系的影响,其中添加Ba GDH的反应速率较快且D-甘露醇转化率是添加Cb FDH的2.1倍,因此将Ba GDH作为辅酶再生用酶用于D-甘露醇的合成。在辅酶体系筛选的基础上,将Lp MDH和Ba GDH粗酶液按照不同比例添加到体外反应体系中,初步测试D-甘露醇转化能力,确定Ba GDH与Lp MDH最佳添加量比为4:1时,转化率最高达82.1%。（3）可调双酶协同表达重组单细胞工厂的构建。在大肠杆菌中串联表达Lpmdh和Bagdh,构建单细胞工厂初步实现D-果糖到D-甘露醇的全细胞转化,D-甘露醇的摩尔转化率为59.7%。为解决全细胞催化体系效率低的问题,根据体外酶量最佳适配比,通过增加Bagdh的拷贝量提高辅酶再生能力、平衡双酶催化速率从而实现D-甘露醇的高效转化,D-甘露醇的摩尔转化率提高至70.5%。（4）全细胞催化体系条件优化。从温度、p H、菌体量和辅底物浓度四个方面优化全细胞催化体系,确定最适条件为反应温度30℃,初始p H值6.5,菌体量OD600 30,辅底物葡萄糖与底物的摩尔比为1:1。（5）5 L发酵罐水平全细胞转化合成D-甘露醇。将工程菌E.coli BL21/p ETDuet-Lpmdh-Bagdh-Bagdh在5 L发酵罐中于最适反应条件下转化24 h,D-甘露醇的最高产量为81.9 g·L-1,摩尔转化率81.9%。