【背景】百草枯(Paraquat,PQ),化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐。PQ作为一种经典的除草剂,在全球范围内的多个国家和地区被广泛地应用。但在长期的使用中发现,PQ对人体有很大的毒性,中毒后死亡率可达90%以上。据美国中毒控制中心统计,在2008年农药中毒死亡人数中因PQ中毒者居首位。研究表明,PQ进入人体后可通过各种途径产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)。过量的ROS会导致氧化应激,严重者会造成多脏器功能障碍。肝脏是人体进行代谢和解毒的重要器官,也是PQ毒性的重要靶点。PQ中毒可引起严重肝损伤,甚至肝功能衰竭。目前PQ诱导肝细胞损伤的详细机制尚不十分清楚。线粒体是细胞内重要的细胞器,可参与物质代谢、ATP的生成及凋亡等多种过程。在产生ATP的过程中,线粒体电子传递链上传递的电子会有少量电子不可避免地“漏出”,并与氧反应生成超氧阴离子自由基和H2O2,这些线粒体来源的ROS称为线粒体活性氧(mitochondria reactive oxygen species,mt ROS)。研究表明,细胞内ROS呈“隔室化”分布,且不同部位来源的ROS所发挥的生物学作用也往往不同。mt ROS除了与ROS一样可导致氧化损伤外,还有抗衰老等保护性作用。近年的研究发现PQ诱发的细胞内ROS的主要来源在于线粒体,但线粒体来源的ROS是否直接参与PQ导致的肝细胞损伤暂不清楚。研究表明,像PQ这类农药对于机体的细胞属于外源性化学物(xenobiotics)。而外源化合物作用于细胞时往往存在敏感时相和非敏感时相,因为细胞周期分为四个时相,即G1期、S期、G2期和M期,而在体外培养基中生长的细胞,则是处在各个周期时相细胞的混合。所以,在以往的实验中PQ作用于非同步化细胞所产生的生物学效应,是对不同时相细胞综合作用结果。因此,无法反映PQ作用的敏感时相,从而不利于阐明其毒性效应机制。研究PQ的作用敏感时相,不仅对PQ自身毒性效应机制研究有重要意义,也会对其它外源性化学物的毒性机制研究具有示范作用。【目的】1.观察PQ导致肝细胞损伤过程中ROS与mt ROS的变化规律;并探讨PQ诱导的损伤与两者之间的关系。2.建立理想的细胞同步化模型并确定细胞周期时相,在同步化基础上进一步研究PQ导致的细胞损伤与ROS及mt ROS之间的关系。3.通过比较PQ引起非同步化与同步化细胞氧化、凋亡损伤效应,明确同步化对于研究PQ中毒机制的重要作用。【方法】1.探讨在非同步化肝细胞中PQ导致的损伤与ROS、mt ROS之间的关系:分别用0、25、50、100、200和300μmol·L-1的PQ对非同步化肝细胞进行干预,24h后检测以下各项指标:用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度的PQ处理后细胞活力的变化;用Annexin V-FITC/PI双标记法检测PQ对凋亡率的影响;DCFH-DA染色法结合流式细胞术测定ROS水平;使用线粒体靶向的Mito SOX染色经激光共聚焦显微镜观察细胞内mt ROS的变化;JC-1染色法对线粒体膜电位水平进行测定。为了明确导致细胞活力发生损伤和凋亡的原因是ROS还是mt ROS,我们对ROS、mt ROS的变化与细胞活力、凋亡率和膜电位的改变进行了Pearson相关性分析。2.建立同步化细胞模型:使用RO-3306进行同步化方法的筛选,通过同步化率和凋亡率的双向筛选选择最佳的同步化方法。同步化处理完成后,收集细胞后用70%的酒精固定,用PI法结合流式细胞术检测细胞周期时相;建立同步化模型后通过释放不同的时间点,根据细胞周期检测结果及光镜和透射电镜的形态学指标,分别确定细胞周期的G1期、S期、G2期和M期。3.在同步化基础上进一步研究PQ导致的肝细胞损伤与ROS及mt ROS之间的关系:将Hep G2细胞同步化至不同时相之后,用PQ处理2h,之后换成正常培养基继续培养24h,用CCK-8法检测细胞活力的变化,DCFH-DA染色法结合流式细胞术测定ROS水平,使用线粒体靶向的Mito SOX染色法经流式细胞术检测细胞内mt ROS的变化,比较不同时相细胞的PQ损伤程度与ROS及mt ROS的变化。【结果】1.PQ可明显损伤细胞活力,并呈剂量效应关系;300μmol·L-1的PQ处理时,可以明显诱导AML12细胞发生凋亡。低剂量的PQ升高线粒体膜电位水平,而高剂量的PQ降低线粒体膜电位。2.PQ可诱发ROS的产生,导致细胞内氧化还原稳态的失衡,虽然低剂量的PQ可以增加mt ROS的水平,但高剂量的PQ使mt ROS的含量下降。因此,PQ对mt ROS的生成具有量效关系,即不同剂量的PQ对mt ROS的影响不同。3.经相关性分析发现PQ导致的细胞活力损伤、凋亡与细胞总ROS的水平有相关性,而与mt ROS的产生无相关性;细胞内ROS与线粒体膜电位改变无相关性,而mt ROS的变化与线粒体膜电位呈正相关。4.在各同步化方法中筛选出的RO-3306阻滞法,可以使同步化达到96%以上,且对细胞的凋亡很小。通过检测释放后不同时间点的细胞周期分布,确定了释放0h为G2期,释放后8h可达到G1期,释放14h可达到S期;结合光镜和透射电镜观察,发现释放1h细胞进入M期,对不同周期的细胞给予PQ处理后发现,不同的时相表现出不同的敏感性。在四个细胞周期时相中,G2期细胞的细胞活力受损最明显。相比G1和S期,G2和M期对PQ引起的凋亡更敏感。5.PQ处理同步化的细胞后检测细胞内ROS和mt ROS发现,G2期细胞内ROS的增加最显著,M期次之,之后分别为G1期和S期。而mt ROS的变化趋势与ROS相反,即S期细胞内mt ROS的水平增加最显著,G1期次之,之后为M期和G2期。6.用RO对细胞进行同步化处理后,不但验证了在非同步化细胞中得出的结果,即细胞内的ROS参与了PQ诱导的肝细胞损伤过程,而且还发现PQ毒性的敏感时相为G2期,且与mt ROS变化相反等更多的特点。【结论】1.在非同步化肝细胞中,PQ诱导细胞内ROS升高,细胞整体水平的ROS介导了肝细胞的损伤;低剂量的PQ增加mt ROS的含量,而高剂量PQ减少mt ROS的水平,mt ROS可能并未直接参与PQ诱导的肝细胞损伤过程。2.对于同步化的不同细胞周期时相的细胞,PQ的毒性损伤作用具有相对选择性,G2期细胞对PQ毒性最敏感,且PQ诱发的ROS越高、mt ROS越低,则损伤程度越大。3.通过比较PQ引起非同步化与同步化细胞氧化、凋亡损伤效应,发现对细胞进行同步化处理并筛选出特定的敏感时相后,各项检测指标的敏感性更高,PQ的毒性效应将会被放大,这对于研究PQ及其它外源性化学物的毒性机制意义重大。