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桔梗是桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jac.q）A.DC的干燥根,是一种著名的传统中药,用于肺部疾病的祛痰和治疗呼吸系统疾病,如咳嗽、感冒、喉咙痛、扁桃体炎和胸闷。桔梗皂苷D（platycodin D,PD）具有抗肿瘤、免疫调节剂、抗炎、抗氧化、成骨等多种生物学活性和药理学作用,是桔梗的主要活性成分及药材质量指标成分。PD是一种理想的疫苗候选佐剂。然而,其佐剂作用确切的机制尚未清楚。本文建立一种灵敏、特异性、操作简单、高通量检测桔梗药材中PD含量的间接竞争性酶联免疫吸附测定方法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA）。在此基础上,根据前期 PD 处理小鼠成肌 C2C12细胞全基因芯片检测结果,选择鞘磷脂代谢二个关键酶--鞘磷脂合酶2（sphingomyelin synthase 2,Sgms2）和中性鞘磷脂酶 2（neutral sphingomyelinase 2,sphingomyelin phosphodiesterase 3,Smpd3）为研究对象,采用C2C12细胞和OVA免疫小鼠,研究其在介导PD佐剂活性中的作用,阐明PD佐剂作用的机制。1.桔梗皂苷D间接竞争性酶联免疫吸附测定法的建立首先分别制备PD与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）的偶联物,以傅立叶红外光谱（FT-IR）和质谱（MS）测定偶联物PD-BSA和PD-HSA的分子量和偶合比;PD-BSA多次肌内注射免疫新西兰白兔,分离兔抗PD血清,柱色谱纯化制备抗PD多克隆抗体（PD-pAb）;ELISA检测PD-pAb的灵敏性和特异性以及PD加样回收率;检测5个产地桔梗药材中PD含量,并与高效液相色谱法（HPLC）检测结果比较。结果表明:FT-IR证实PD-BSA和PD-HSA偶联成功;MS检测显示PD-BSA和PD-HSA的耦合比分别为1.5:1和2:1;兔抗PD血清效价水平达1:640000;PD检测范围为0.032 μg/ml-100 μg/ml;PD-pAb与PD同系物几无交叉反应（<0.93%）;PD平均回收率为97.14%（RSD=1.17%）;icELISA方法检测桔梗5个产地不同药材中PD含量结果与HPLC分析结果的相关系数为0.9654。本实验建立的icELISA是一种适于检测桔梗药材中PD含量的简便、价廉、快速、灵敏、可靠、高通量方法。2.鞘磷脂合酶2介导桔梗皂苷D佐剂活性的作用研究根据PD对小鼠成肌C2C12细胞基因芯片检测数据,进行生物信息学分析,选择Sgms2为研究对象。制备pCDNA3.1（-）-Sgms2重组质粒,构建Sgms2过表达C2C12稳转细胞株;采用RT-qPCR、ELISA与Western blot检测C2C12细胞炎性因子基因和蛋白表达水平以及Smpd3酶活,扫描电镜观测C2C12细胞形态,研究Sgms2获得性功能。利用siRNA与特异性抑制剂D609检测Sgms2敲低和抑制对PD调控C2C12细胞炎症因子表达的影响;D609预处理对PD肌注局部组织炎性因子水平、免疫细胞募集和摄取能力的影响,研究Sgms2体内外缺失性功能。免疫荧光分析方法（IFA）观察PD在C2C12细胞的定位,胆固醇去除剂甲基-β-环糊精（Me-β-CD）对PD调控C2C12细胞Sgms2及炎症因子表达的影响,研究Sgms2的上游调节因子。ELISA检测抑制剂D609对PD联合OVA受免小鼠血清中抗原特异性抗体效价的影响,探讨Sgms2在介导PD佐剂活性中的作用。结果显示:Sgms2过表达可显著上调C2C12细胞胆固醇羟化酶（Ch25h）与炎性因子COX-2基因和蛋白表达水平,下调Smpd3基因和蛋白表达水平,抑制Smpd3酶活。siRNA干扰和抑制剂D609能拮抗PD诱导C2C12细胞炎症因子基因和蛋白表达。D609预处理能降低PD肌注股四头肌组织中炎症因子基因和蛋白表达水平,拮抗PD诱导肌注部位局部组织树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞的募集,抑制树突状细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞摄取抗原的能力。PD处理早期主要结合于C2C12细胞膜;PD可显著降低C2C12细胞胆固醇含量,Me-β-CD预处理可抑制PD诱导C2C12细胞Sgms2和COX-2基因和蛋白表达。D609预处理能显著降低PD联合OVA受免小鼠血清中OVA特异性抗体效价。PD可通过降低胆固醇,激活Sgms2,诱导炎性反应,从而发挥佐剂作用。3.中性鞘磷脂酶2介导桔梗皂苷D佐剂活性的作用研究鉴于PD能显著下调C2C12细胞Smpd3基因表达水平,故首先检测PD对C2C12细胞Smpd3酶活的影响。同时,采用RT-qPCR、ELISA和Western blot检测Smpd3抑制剂GW4869预处理对PD处理C2C12细胞以及PD肌注股四头肌组织炎症因子表达水平、以及PD联合OVA受免小鼠血清中抗原特异性抗体效价的影响,探讨Smpd3在介导PD佐剂活性中的作用。结果显示:PD能显著抑制C2C12细胞Smpd3酶活;GW4869预处理促进PD诱导C2C12细胞COX-2、IL-6、IL-1β、MIP-2、MIP-1β的mRNA表达,提高PD肌注股四头肌组织IL-6、MIP-2和MIP-1α水平,以及PD联合OVA受免小鼠血清中OVA特异性。上述结果说明Smpd3参与PD对OVA的佐剂活性。