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目的:Gp78是主要定位于内质网的E3泛素连接酶,其在内质网相关降解(endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD)中起到重要作用,目前已有证据证实gp78参与阿尔茨海默病(Alzheimer’s diasease,AD)及肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等神经退行性疾病的发病过程,而其在帕金森病(Pakinson’s disease,PD)尚未见报道。本研究探讨gp78是否参与PD的发病过程,并进一步探讨其作用机制。方法:(1)在亚急性MPTP小鼠模型(帕金森病动物模型)的黑质组织和MPP+处理原代神经元(帕金森病细胞模型)中,分别应用Western blotting、免疫荧光技术及RT-PCR技术检测gp78蛋白水平和mRNA水平在帕金森病发病过程中神经元中表达情况;(2)应用免疫共沉淀检测CDK5与gp78蛋白的结合,应用Western blotting及免疫荧光技术检测CDK5活性上调对gp78蛋白水平的影响,并应用CDK5抑制剂Roscovitine检测CDK5抑制对帕金森病细胞模型中gp78下调的影响;(3)应用生物信息学预测gp78是否为CDK5磷酸化底物,并应用体外激酶反应、Phos-tag SDS-PAGE凝胶及磷酸化质谱等方法,在体内体外验证CDK5可直接磷酸化gp78;(4)研究神经元中gp78的降解途径,并在帕金森病细胞模型中研究CDK5磷酸化gp78对其降解途径的影响;(5)在帕金森病细胞模型中应用MTT法检测上调gp78或应用肉豆蔻酸修饰的gp78穿膜肽(myr-RPALNSPVERP短肽,包含CDK5磷酸化gp78的磷酸化位点,可抑制CDK5对gp78的内源性磷酸化)对帕金森病细胞模型中神经元存活的影响。结果:(1)在亚急性MPTP小鼠模型的黑质组织和MPP+处理原代神经元中帕金森病中gp78蛋白水平均明显下降,但gp78的mRNA水平没有明显变化;(2)在神经元中可检测到CDK5的配体p35和gp78蛋白的结合,在细胞中上调CDK5,可显著降低gp78的蛋白水平,而应用CDK5抑制剂Roscovitine可阻止MPP+处理原代神经元中gp78蛋白的降解;(3)应用多种生物信息学软件联合预测结果提示gp78的丝氨酸516位点(S516)有可能是CDK5的磷酸化位点,进一步通过体外激酶反应、Phos-tag SDS-PAGE凝胶及磷酸化质谱等方法在体内体外验证CDK5可在神经元细胞中直接磷酸化gp78的S516位点;(4)实验验证在MPP+处理神经元细胞中,gp78主要通过泛素蛋白酶体途径降解,而CDK5磷酸化gp78的S516位点可显著增加gp78蛋白的泛素化水平,并促进gp78蛋白经泛素蛋白酶体途径降解;(5)在MPP+处理的原代神经元中,过表达gp78或给予gp78穿膜肽阻断CDK5对gp78的磷酸化均可以保护MPP+引起的神经元死亡。结论:在帕金森病内质网相关降解途径中关键蛋白gp78的蛋白水平在神经元中显著降低,其主要通过泛素-蛋白酶体通路降解:神经系统关键激酶CDK5可直接磷酸化gp78蛋白的S516位点,gp78蛋白S516位点的磷酸化可促进gp78蛋白的泛素化及泛素-蛋白酶体途径降解;在神经元中过表达gp78或干扰CDK5磷酸化gp78均可保护帕金森病模型中神经元的死亡。