西瓜(Citrullus lanatus)是广受世界各地人们所喜爱的水果之一，然而作为冷敏感型的植物，在其早期的栽培中常常受到冷害的影响，严重限制其产量。很多研究表明交替呼吸途径在植物对生物和非生物胁迫的抗性中起到非常重要的作用。为了研究低温胁迫条件下交替呼吸途径对西瓜抗性的调控作用，本实验通过抑制性差减杂交的方法构建了低温(10℃)胁迫下抗低温西瓜种质IVSM9在交替呼吸途径被抑制后的下调表达基因文库。　　 低温(10℃)24小时后，可明显看到SHAM(线粒体交替呼吸途径抑制剂)预处理的植株同水处理植株相比表现出明显的冷害性状。通过测定对照和SHAM处理植株的总呼吸和交替呼吸强度发现，2 mM SHAM可以显著地抑制大约55％的交替呼吸强度。因此，抑制交替呼吸途径可以显著降低西瓜的抗冷性。　　 运用抑制性差减杂交(SSH)的方法，我们以正常植株作为tester，以SHAM处理植株作为driver，构建了一个含有500个克隆的差减文库。从中挑选出400个阳性克隆，并全部进行测序。对测得的序列进行cluster分析，得到低温下SHAM处理后下调表达的非重复基因片段314条。通过在Arabidopsis Information Resource(TAIR)上进行BLASTN和BLASTX分析，发现有30条编码未知蛋白，94条没有任何的同源性，其余一些具有显著同源性的基因，根据其编码蛋白的功能，主要参与能量和代谢过程、胁迫和抗性反应、信号转导、转录调控、蛋白命运、蛋白合成、细胞内转运及其它一些细胞生物学功能。这些基因分布于植物细胞中的各个组成部分，表明交替呼吸途径可以对细胞线粒体外的环境产生深刻的影响。总的来说，这些结果说明西瓜线粒体交替呼吸途径在调控植物的低温胁迫反应上发挥重要的作用，它可以在各种生物化学和分子生物学途径上影响植物的低温胁迫反应。　　 为了进一步的验证差减杂交结果的可靠性。我们从差减文库中选出一些基因，分别选取低温处理后0、6、12、24、48小时的植株进行荧光定量PCR分析，研究这些基因在SHAM处理和对照植株间的差异表达情况。常温条件下，SHAM处理同对照相比会诱导一些基因的表达；低温条件下，这些基因均被低温不同程度的诱导，表达倍数在几十甚至几百之间，表明这些基因均对低温胁迫呈现出不同程度的响应。但同对照相比，SHAM处理后这些基因的表达呈显著下调趋势，有些基因在前6个小时或12小时在SHAM处理植株中表达高于对照；而有些基因在整个低温的过程，在SHAM处理植株中表达始终低于对照。各种各样的参与各种细胞生命活动的基因在SHAM处理和对照植株之间，以及相同处理植株的不同时间点之间，均表现出各种各样不同的动态变化模式，这表明不同的细胞生命活动在低温下都将会进行适当的调整，以适应低温环境，提高植物的低温抗性。交替呼吸途径被抑制后这些基因的表达同样呈现出各种不同的变化模式，但在最初的动态变化和调整后，这些基因均在12或24小时后表现出下调表达的趋势。因此，SHAM处理可以显著抑制一些基因的表达。　　 同时我们克隆到了西瓜交替氧化酶AOX2基因，对其编码的蛋白质序列进行了同源性分析，发现它同许多交替氧化酶基因一样，存在很多保守的功能位点；组织表达和低温表达分析发现，它并不对低温胁迫产生响应，但是可能在西瓜果实成熟的过程中发挥作用。　　 此外，我们从差减文库中发现许多未知的cDNA，并且克隆到了一个编码未知蛋白的基因。它可能是一条受交替呼吸途径调控的低温诱导新基因。对这条新基因的研究不仅有助于我们了解西瓜对低温胁迫的响应机制，同时对于我们研究西瓜线粒体交替呼吸途径通过反向调控机制调控整个细胞的低温抗性都具有重要意义。