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多巴胺(dopamine,DA)是中枢神经系统中一种儿茶酚胺类的神经递质,在学习记忆、运动控制、动机、认知控制和奖赏等高级脑功能中扮演重要角色。多巴胺受体(DA receptor,DR)具有五种受体亚型,其D1和D5受体为D1型受体(D1-like receptor,DR1),D2、D3和D4受体属于D2型受体(D2-like receptor,DR2),它们均可与G蛋白耦联调节蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的活性,从而影响下游事件。研究发现,中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)和黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNC)发出的DA能神经纤维投射至海马结构,DA可通过改变PKA活性调节膜上离子通道,参与调节海马神经元的长时程增强(long-term potential,LTP)和长时程抑制(long-term depression,LTD)。由此,猜测DA可能参与调节海马神经元的形态,但目前有关这方面的研究鲜有报道。因此,本研究主要从形态方面探讨DA对海马神经元突触发育的调节。实验室早期研究发现,环境内分泌干扰物双酚A(bisphenol-A,BPA)通过干扰性激素活性而影响大脑的正常发育、功能活动和突触可塑性。有研究表明,产前BPA暴露影响中脑多巴胺系统和海马树突棘突触完整性发育,这可能导致由DA调节的功能如工作记忆的执行,对运动的控制和奖赏途径的调节等产生不利后果。此外,BPA能改变幼年期和成年期小鼠的DA和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)相关基因的转录。由此推测:BPA可能影响DA调节海马神经元的突触形态可塑性。综上所述,本研究主要采用原代培养新生海马神经元,探究不同剂量DA对海马神经元树突棘和突触发育的影响;然后用DA的DR1拮抗剂(SCH 23390)和DR2拮抗剂(Sulpiride)探究其不同类型受体是否参与DA调节海马神经元形态;并通过Western Blot分析DR1和DR2蛋白的表达水平,进一步研究DA调节突触形态可塑性的分子机制;接着,用ERK1/2信号通路抑制剂(U0126)和P38信号通路抑制剂(SB203,580)进一步分析DA影响海马神经元的可能机制。最后,将BPA与DA共同处理,探究BPA是否影响DA对海马神经元形态的调节作用。实验方法:取出生24 h内的健康SD仔鼠,分离海马神经元,离体培养至11天DA(0.1μM、1μM、10μM、100μM、1 mM和10 mM)处理1 h,利用罗丹明标记的鬼笔环肽特异性结合神经元的肌动蛋白F-actin,再使用激光共聚焦扫描显微镜观察并采集图片,最后利用Meta Morph软件统计30μm长度二级树突上的树突棘数量,探究DA对海马神经元树突棘生成的影响。用Synapsin-I单克隆抗体与Alexa 488标记的绿色荧光二抗特异性结合,定位神经元突触前标志性蛋白Synapsin-I,再将F-actin与Synapsin-I共同定位突触,分析DA对海马神经元突触发育的影响。实验结果:1.0.1μM-10 mM的DA处理1 h,发现低剂量(0.1μM-100μM)DA增加海马神经元的树突棘密度(P<0.01或P<0.001),且1μM DA促进效果最佳,高剂量(10 mM)DA降低树突棘密度(P<0.001);同时,低剂量(1μM、100μM)DA增加海马神经元的突触密度(P<0.001或P<0.05),高剂量(1-10 mM)DA降低突触密度(P<0.001)。提示:DA剂量依赖地双向调节海马神经元树突棘生长和突触发育,即低剂量促进而高剂量抑制树突棘形成和突触发育。2.DR1拮抗剂SCH23390(1μM)预处理0.5 h完全阻断1μM DA对海马神经元树突棘和突触密度的促进作用(P<0.001),但不影响10 mM DA对树突棘和突触密度的抑制作用(P>0.05);DR2拮抗剂Sulpride(10μM)预处理0.5h不影响1μM DA的促进作用(P>0.05),但消除10 mM DA对海马神经元树突棘和突触密度的抑制作用(P<0.001);而以上两种拮抗剂单独处理均对树突棘和突触密度无明显作用。提示:DA通过DR1促进海马神经元的树突棘生长和突触发生,通过DR2抑制树突棘形成和突触发育。3.Western Blot分析进一步发现,1μM DA明显上调海马神经元DR1蛋白的表达水平(P<0.05),而10 mM DA明显上调DR2蛋白的表达水平(P<0.01)。这些结果进一步提示:低剂量DA主要通过海马神经元DR1调节树突棘形成和突触发育,而高剂量DA对树突棘生成和突触发育的抑制作用与DR2有关,从蛋白分子水平证明DA通过激活DR调节海马神经元的突触发育。4.为进一步探究DA调节的信号通路,在DA处理前用ERK1/2信号通路抑制剂(U0126,25μM)预处理0.5 h,完全消除1μM DA对海马神经元树突棘密度(P<0.001)和突触密度(P<0.01)的促进作用;P38信号通路抑制剂(SB203,580,10μM)预处理0.5 h明显消除10 mM DA对树突棘(P<0.05)和突触密度(P<0.01)的抑制作用;同样两种抑制剂单独处理时对神经元无明显影响。提示:ERK1/2信号通路参与低剂量DA对海马神经元树突棘生成和突触发育的促进作用;高剂量DA对海马神经元树突棘生成和突触发育的抑制作用可能通过P38信号通路介导。5.BPA(100 nM)与低剂量DA(1μM)共同处理时,BPA和DA单独处理时对海马神经元树突棘密度和突触密度的促进作用消除(P<0.001);BPA(100nM)与10 mM的DA共同处理时,BPA完全消除DA对神经元树突棘密度(P<0.001)和突触密度(P<0.05)的抑制作用。提示:BPA影响DA对海马神经元树突棘生成和突触发育的调节作用。结论:DA剂量依赖地双向调节海马神经元的突触发育,低剂量(1μM)DA通过DR1介导的ERK1/2信号通路促进海马神经元的突触发育;高剂量(10 mM)DA通过DR2介导的P38信号通路抑制海马神经元的突触发育。此外,BPA抑制DA对海马神经元突触发育的调节作用。