黑色素瘤是一种极具侵染性的恶性皮肤癌。近三十年来,其世界范围内发病率持续升高。对于黑色素瘤的治疗目前主要采用外科手术和化疗相结合的方法,但黑色素瘤很容易对化学药物产生耐药性,从而限制了其使用。因此,以新的思路建立新的黑色素瘤治疗策略势在必行。黑色素瘤具有增殖迅速,易侵袭和转移等特点。研究表明,受体酪氨酸激酶(RTK)通路的过度活化在黑色素瘤的发生发展过程中发挥了关键作用。造成其RTK通路持续活化的一个重要原因就是黑色素瘤细胞内源性RTK通路抑制蛋白的缺失。s prouty蛋白是内源性RTK通路抑制蛋白,其首先在果蝇发育过程中被发现,迄今为止,已经在哺乳动物中发现了四种Sprouty家族蛋白(Sprouty1-4)。有研究表明,Sprouty蛋白在很多黑色素瘤细胞中表达下调或者不能发挥其原有的抑制功能。因此,在黑色素瘤中恢复表达Sprouty类蛋白有可能在一定程度上抑制RTK通路的异常活化,从而抑制黑色素瘤的生长,为黑色素瘤的治疗提供新的手段。在本文第一部分中,我们通过脂质体转染的方式在小鼠黑色素瘤细胞B16F10中分别过表达了Sprouty家族中两个成员Sproutyl和Sprouty2 (Sproutyl/2),并发现过表达这两种蛋白都可以导致B16F10细胞生长的抑制。进一步研究发现,Sproutyl/2的过表达可以明显抑制B16F10细胞ERK1/2的磷酸化,并导致细胞周期G1期阻滞。另外,我们也发现,Sproutyl/2过表达不会对B16F10的细胞凋亡产生显著影响。综上所述,Sproutyl/2过表达可以通过诱导B16F10细胞周期G1期阻滞、抑制其增殖,这为进一步利用Sproutyl/2进行黑色素瘤治疗创造了条件。沙门氏菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌,其减毒株VNP20009可以携带外源基因表达质粒靶向性向肿瘤聚集,并在肿瘤组织中特异性地表达外源蛋白,因此常被作为一种肿瘤靶向性载体用于肿瘤基因治疗。在本文第二部分中,我们通过减毒沙门氏菌株VNP20009在厌氧启动子NirB控制下通过沙门氏菌三型分泌系统在B16F10肿瘤组织中分泌表达Sprouty1和Sprouty2蛋白,并评价和探讨了其抗肿瘤能力以及可能的机制。实验首先研究了携带Sproutyl1 和 Sprouty2表达质粒的VNP20009 (VNP-Sproutyl, VNP-Sprouty2)在荷瘤小鼠体内的分布。菌落形成实验表明,VNP-Sprouty1 和 VNP-Sprouty2都优先在肿瘤组织中聚集和复制,表现出良好的肿瘤靶向性。实验接下来分别在体外和体内证实了Sprouty1 和 Sprouty2可以厌氧特异性表达。对荷瘤小鼠肿瘤组织免疫组化研究表明,外源蛋白主要在肿瘤组织坏死区表达。动物实验结果表明,同VNP-Vector相比,VNP-Sprouty2可以显著抑制B16F10黑色素瘤生长并延长动物生存时间,其肿瘤倍增时间和肿瘤延迟时间也都得到显著增加。但是,VNP-Sprouty1 和 VNP-Vector相比却没有显著治疗效果。为了进一步研究VNP-Sprouty2抗肿瘤的机制以及VNP-Sprouty1和VNP-Sprouty2抗肿瘤能力差异的原因,我们分析了经细菌治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织ERK1/2磷酸化的情况。结果表明,同VNP-Vector相比,VNP-Sprouty2可以显著抑制荷瘤小鼠肿瘤组织中ERK1/2的磷酸化,而、NP-Sprouty1虽然也可以造成一定程度的抑制,但没有表现出显著的差异。实验进一步通过对肿瘤组织进行Ki-67免疫组化染色分析了细菌治疗后肿瘤细胞增殖的情况。结果表明,VNP-Sprouty2可以显著抑制肿瘤细胞的增殖,而VNP-Sprouty1同VNP-Vector相比没有明显差异。这些结果同VNP-Sprouty1 和 VNP-Sprouty2所表现出的不同的抗肿瘤能力相符,提示VNP-Sprouty1和、NP-Sprouty2在体内对黑色素瘤ERK1/2磷酸化抑制能力的不同可能是它们具有不同抗肿瘤能力的一个重要原因,同时也表明Sprouty2是更适合用于黑色素瘤基因治疗的一个元件。综上所述,本研究通过VNP20009在肿瘤组织中厌氧特异性表达Sprouty2,显著抑制了B16F10黑色素瘤的生长,延长了肿瘤倍增时间和肿瘤延迟时间以及荷瘤小鼠的生存时间。我们的研究为黑色素瘤的治疗提供了一种潜在有效的新策略。