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十字花科蔬菜菌核病,是由核盘菌(Sclertinia sclerotiorum)引起的一种病害,每年造成巨大的经济损失,查尔酮合成酶(Synthetase chalconeCHS)是苯丙氨酸代谢途径的关键酶,合成的查尔酮为类黄酮提供基本碳骨架,在植物的抗病性中起到重要作用。草酸氧化酶(oxalate oxidaseOXO)在生物界降解草酸的过程中起到十分重要的作用,它通过降解草酸,产生H2O2和CO2,在植物的抗病防御中发挥重要功能。 本研究以花椰菜和拟南芥为材料,采用同源克隆的方法从花椰菜中克隆了CHS和OXO基因,对OXO基因进行生物信息学分析,并将他们转入拟南芥与花椰菜,探究CHS和OXO基因在植物抗病性与生长发育中的作用。 1.成功的克隆了花椰菜OXO和CHS基因DNA与cDNA全长,序列分析显示,花椰菜OXO基因编码206个氨基酸,属于cupin家族。BoOXO氨基酸序列与油菜、拟南芥germin-like蛋白同源性达97%与88%,BoOXO蛋白为疏水性蛋白,无跨膜区。 2.成功构建植物表达载体pC3301-BoOXO与pC3301-BoCHS,并用农杆菌介导法成功转入拟南芥与花椰菜,经过Basta抗性筛选,分子鉴定,获得BoOXO转基因阳性拟南芥2株,花椰菜16株;得到BoCHS转基因阳性拟南芥3株,花椰菜7株。 3. T3代拟南芥的表型分析显示,异位表达BoOXO基因,可促进拟南芥侧根的生长,叶片、花与果荚的增大,提高结实率;异位表达BoCHS基因可导致拟南芥叶片与花器官的增多,叶片与果荚的增大,提高结实率。 4.转基因花椰菜的核盘菌胁迫分析显示,与野生型花椰菜相比,在病原胁迫的不同时期,转基因植株中BoOXO、BoCHS基因的表达量显著增强,与查尔酮合酶、草酸氧化酶在油菜、向日葵、烟草等中的抗病作用一致,说明花椰菜BoOXO、BoCHS基因也是抗菌核病的重要基因。