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结肠癌(colorectal cancer,CRC)是人类疾病中常见的消化系统恶性肿瘤,发病率位居人类恶性肿瘤第三位。临床上多表现为消瘦、贫血、便血、腹痛等,其易发生远处转移,约50%患者发现时已发生肝转移,因此患者在病程后期常因梗阻性黄疸、肝衰竭等原因死亡。目前结肠癌治疗上虽然以外科手术为主,但是药物抗肿瘤治疗亦是重要治疗手段,有助于患者病情的控制,提高患者生命质量。人类恶性肿瘤的发生不仅与细胞的异常增生有关,还与细胞的凋亡受阻,致使肿瘤细胞无限制恶性增生有密切关系。恶性肿瘤的转移过程中包括血管生成、细胞粘附、侵袭、转移及增殖等等。因此,细胞凋亡在控制肿瘤细胞增殖、肿瘤发生及肿瘤生长过程中起到至关重要的作用。现代药理学研究发现,一些中国传统中药具有很好的抑制肿瘤生长作用。天花粉为葫芦科植物瓜萎或双边瓜萎的干燥根,现代药理学研究发现其具有终止妊娠、抗肿瘤、抗炎抑菌、抗病毒等多种药理活性。天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是一种从中药瓜萎块根中分离提纯的有效成分,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有RNAN-糖苷酶活性,能够水解真核细胞核糖体28SrRNA特定位点的腺苷酸,从而抑制细胞蛋白质的合成。既往实验发现,TCS具有潜在的抗肿瘤作用。本文研究天花粉蛋白抑制结肠癌细胞生长作用,并在细胞内进行天花粉蛋白及其突变体Y(酪氨酸)70A(丙氨酸)、R(精氨酸)163Q(谷氨酰胺)TCS生物活性功能研究。结果显示:(1)TCS对结肠癌HCT116细胞的生长有明显的抑制作用,HCT116细胞出现细胞皱缩、变形,并且细胞凋亡呈现明显的浓度和时间依赖性;(2)TCS可将结肠癌HCT116细胞阻滞于S期;(3)TCS可诱导HCT116细胞发生凋亡;(4)Western blotting检测结果显示caspase-3酶原,caspase-9酶原,PARP表达降低,呈现浓度依赖性。TCS处理可活化Akt、pAkt上升;(5)在细胞内,野生种TCS能抑制荧光素酶活性,突变体Y70A则不能抑制荧光素酶活性,而突变种R163Q对荧光素酶活性抑制作用强于野生种TCS。本研究共分为两部分内容。第一部分TCS抑制结肠癌HCT116细胞生长作用的研究研究目的:研究天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)对人结肠癌细胞生长抑制的影响。研究方法:人结肠癌HCT116细胞,分设TCS实验组(浓度分别为7.0μM、14μM、28μM)和阴性对照组。实验中(1)采用倒置显微镜观察TCS对HCT116细胞形态及增殖的影响;(2)采用流式细胞仪检测TCS对HCT116细胞周期以及TCS对HCT116细胞凋亡影响;(3)应用 Western blotting 检测结肠癌 HCT116 细胞 caspase-3 酶原,caspase-9 酶原;PARP;pAkt;Akt变化。研究结果:(1)TCS处理明显抑制结肠癌HCT116细胞的生长,HCT116细胞出现细胞皱缩、变形,体积变小,并且细胞凋亡呈现明显的浓度和时间依赖性;(2)TCS可将结肠癌HCT116细胞阻滞于S期;(3)TCS可诱导HCT116细胞发生凋亡;(4)Western blotting法检测结果显示caspase-3酶原,caspase-9酶原,PARP表达降低,呈浓度依赖性。TCS处理激活Akt,磷酸化Akt升高。研究结论:TCS可抑制结肠癌HCT116细胞生长,呈药物浓度和作用时间依赖性。TCS可将HCT116细胞阻滞于S期,并诱导HCT116细胞凋亡。caspase-9、caspase-3的激活为介导TCS诱导HCT116细胞发生凋亡的通路,结果提示与PI3K/Akt通路调节有关系。第二部分天花粉蛋白及其突变体Y70A、R163Q TCS生物活性研究研究目的:在细胞内进行天花粉蛋白野生种(TCS)及天花粉蛋白突变体Y70A、R163Q TCS生物活性比较;研究方法:以pAAV-CMV-TCS为载体,通过定点突变、质粒转化、扩增、提取、测序、转染等方法构建突变种Y70A、R163Q TCS。在细胞内通过荧光素酶活性测定,进行野生种TCS与突变种TCS活性比较。研究结果:荧光素酶报告基因检测,单独或与野生种TCS、突变种Y70A、R163Q共转染293T细胞。在细胞内,野生种TCS能抑制荧光素酶活性,突变种Y70A则不能抑制荧光素酶活性,而突变种R163Q对荧光素酶活性抑制作用强于野生种TCS。研究结论:通过野生种TCS,突变种Y70A和R163Q在细胞内对荧光素酶活性影响的比较,结果显示Tyr70、Arg163为天花粉蛋白活性结构中重要氨基酸。