目的:食物过敏是常见的过敏反应,特异性脱敏治疗是从过敏性疾病的病因入手,改变过敏原进入体内后的反应进程而进行的治疗手段。随着抗原表位认识的深入,分子诊断和生物技术手段的发展,特异性脱敏治疗已进入耐受原精细化阶段。牛奶是常见的食物过敏原,Bos d 5是其重要的过敏组分。本课题以牛奶过敏组分Bos d 5为研究对象,分析其抗原表位,经设计构建和生物预测,得到最终的耐受原分子B5M氨基酸序列,利用原核系统表达得到B5M纯化蛋白分子。经过敏原性和免疫原性分析,初步证明其过敏原性降低,免疫原性保留,可作为牛奶过敏单组份脱敏治疗的备选疫苗分子,并为食物过敏特异性脱敏治疗提供新思路和新方法。方法:1.耐受原分子B5M的设计构建由文献和NCBI网站查得Bos d 5氨基酸序列和关键表位,以破坏其构象表位同时保留T细胞表位为原则,设计得到备选耐受原分子B5M的若干氨基酸序列,利用生物信息学在线预测网站和预测软件进行亲水性,二级结构和抗原性分析,优选出最优耐受原分子B5M氨基酸序列。2.耐受原分子B5M的制备根据得到的B5M氨基酸序列,我们进行基因合成,质粒构建,利用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达,经包涵体处理和亲和纯化后,最终得到B5M蛋白。3.耐受原分子B5M的生物活性分析B5M的过敏原性分析是利用斑点印迹实验(Dot-blot)和酶联免疫吸附实验(ELISA)分析制备得到的耐受原B5M与血清中游离的Bos d 5特异性IgE的结合能力;同时利用血清致敏嗜碱性粒细胞激活试验(IgE-BAT)验证B5M与嗜碱性粒细胞表面受体上特异性IgE的结合能力。B5M的免疫原性分析是利用B5M和重组Bos d 5分别免疫家兔得抗血清。ELISA抑制实验验证耐受原分子B5M抗血清抑制过敏原Bos d 5与血清中游离特异性IgE结合的能力。BAT抑制实验验证B5M抗血清抑制过敏原Bos d 5与细胞表面受体上特异性IgE结合的能力。T细胞增殖试验验证B5M是否保留了野生型过敏原的T细胞表位。利用MTT法进行此部分实验。结果:1.耐受原分子B5M设计构建对Bos d 5进行表位分析,设计构建得到若干备选蛋白分子,经生物信息学预测其亲水性,抗原性及二级结构变化,筛选得到耐受原B5M的氨基酸序列。2.耐受原分子B5M的制备经原核表达和亲和纯化,得到B5M蛋白分子,其分子量约为52 kDa。圆二色谱分析证明B5M二级结构与过敏原Bos d 5相比发生明显变化,并且二硫键消失。3.耐受原分子B5M生物活性分析B5M过敏原性分析:Dot-blot实验证明耐受原分子B5M与过敏患者血清中游离特异性IgE的结合能力下降,10例血清均未显色;ELISA结果证明B5M与20例牛奶过敏患者血清中游离特异性IgE的结合能力下降到67.84%-45.48%之间,平均值为58.22%。IgE-BAT实验证明不同浓度的耐受原B5M(0.001-10 ng/ml)与分别用4例牛奶过敏患者血清提前致敏的嗜碱性粒细胞表面受体上的特异性IgE的结合引起嗜碱性粒细胞激活指数与不同浓度的重组Bos d 5的刺激指数相比,明显下降(p<0.05)。本部分实验证明耐受原分子B5M过敏原性较Bos d 5降低。B5M免疫原性分析:重组Bos d 5和耐受原分子B5M免疫家兔得到相应的抗血清。ELISA抑制实验证明耐受原分子B5M家兔抗血清可抑制过敏患者血清游离特异性IgE与过敏原Bos d 5的结合,结果证明耐受原分子B5M抗血清抑制血清特异性IgE与过敏原结合的抑制率在51.53%-75.43%之间,重组Bos d 5抑制率在42.24%-66.67%之间,二者间没有统计学差异。BAT抑制实验证明耐受原分子B5M和重组Bos d 5家兔抗血清均可抑制嗜碱性粒细胞表面受体上的IgE与过敏原Bos d 5的结合。B5M T细胞表位完整性分析:MTT实验证明与重组Bos d 5相比,耐受原B5M保留了原过敏原的T细胞表位,为体内保护性抗体的产生提供了前提条件。结论:本课题以牛奶过敏原Bos d 5为研究对象,设计构建耐受原分子B5M进行牛奶单组分特异性脱敏治疗的研究。经设计构建,生物信息预测得到B5M的氨基酸序列。经表达纯化得到耐受原蛋白分子。经生物活性分析,证明B5M过敏原性降低,免疫原性保留。故B5M可作为牛奶过敏单组分特异性脱敏治疗的候选分子,为食物过敏特异性脱敏治疗提供理论支持。