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研究目的:肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一种常见的功能性胃肠道疾病,在全球范围内都有着广泛的分布,其症状主要包括腹痛、腹胀以及排便习惯的改变。IBS的发病机理复杂,迄今为止其发病机理尚未完全清楚。早期的生活压力会对社会行为和情绪发展产生影响。我们通过新生期母爱剥夺(Neonatal maternal deprivation,NMD)来模拟这种早期的生活压力进而诱导Sprague Dawley(SD)大鼠产生慢性内脏痛敏。酸敏感离子通道1(Acid-sensing ion channel 1,ASIC1)在疼痛的调控过程中发挥着重要的作用。钠钾氯协同转运蛋白1(Na+-K+-cl--cl--1,NKCC1)是一种阳离子氯离子共转运蛋白,可以调节细胞内外Cl-浓度,同时在疼痛的调控过程中起着重要作用。但是在慢性内脏痛敏发展的过程中ASIC1以及NKCC1是否发挥重要的调控作用以及两者是否具有调控关系都尚未完全清楚。因此,本课题主要集中研究ASIC1和NKCC1在慢性内脏痛敏中的作用及其调控机制,进而有望为慢性内脏痛的治疗找寻新的治疗靶点和方向。方法:1.NMD模型的建立:新生大鼠从出生第二天开始,每天与母鼠分离3 h后再放回母鼠身边,连续分离14天,对照组CON不做任何处理。待幼鼠成长至6周,通过结直肠扩张实验(Colorectal distention,CRD)检测腹壁撤回评分并以此来评估SD大鼠是否产生内脏痛敏反应。2.脊髓片膜片钳记录:检测CON和NMD大鼠T13-L2段脊髓背角神经元的兴奋性以及突触传递的变化。3.Western Blotting实验:检测ASICs、NKCC1和KCC2蛋白表达变化。4.鞘内注射ASICs的抑制剂阿米洛利(Amiloride)或NKCC1抑制剂布美他尼(Bumetanide,BMT)检测其对NMD大鼠内脏痛敏的影响。5.脊髓片膜片钳记录:检测孵育ASICs的抑制剂Amiloride或NKCC1抑制剂BMT前后突触传递的变化。6.免疫荧光实验:检测ASIC1在脊髓背角的分布及其细胞类型。结果:1.NMD大鼠在6周龄出现明显的内脏痛敏现象,并且T13-L2段脊髓背角中ASIC1蛋白表达明显上调。同时,免疫荧光实验发现ASIC1与脊髓背角的浅层神经元共标,而与星形胶质细胞和小胶质细胞不共标。2.与CON大鼠相比,NMD大鼠T13-L2段脊髓背角神经元的兴奋性显著增强,同时兴奋性突触传递显著增强,抑制性突触传递显著减弱。3.鞘内注射ASICs的抑制剂Amiloride可以显著翻转NMD大鼠的慢性内脏痛敏现象。4.NMD大鼠T13-L2段脊髓背角NKCC1的表达显著上调,KCC2表达无显著变化,并且鞘内注射NKCC1的抑制剂BMT可以显著翻转NMD大鼠的慢性内脏痛敏现象。5.孵育Amiloride显著降低NMD大鼠脊髓背角mEPSCs的幅度,而不影响mEPSCs的频率,提示ASIC1通过突触后机制增强兴奋性突触传递。孵育BMT显著升高NMD大鼠脊髓背角mIPSCs的幅度,而不影响mIPSCs的频率,推测NKCC1通过突触后机制降低抑制性突触传递。6.NMD大鼠鞘内注射Amiloride可以显著翻转脊髓背角NKCC1的表达。结论:NMD大鼠脊髓水平的ASIC1和NKCC1的表达增加,使脊髓背角兴奋性突触传递增强,抑制性突触传递减弱,导致脊髓中枢敏化,进而产生慢性内脏痛。