一、立题依据和目的 自然杀伤(NK)细胞来源于骨髓，主要存在于血液和淋巴样组织，约占外周血淋巴细胞的5-10％。NK细胞属于淋巴细胞谱系细胞群，是自然免疫反应的重要效应因子。NK细胞无需抗原刺激，就能杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞，是重要的免疫效应/调节细胞。 NK细胞的生物学效应依赖于其表面受体和相应配体的相互作用。NK细胞受体通过结合MHCI类分子或其他配体，调节NK细胞的活性。NK细胞受体包括免疫球蛋白样NK细胞受体(KIR、NCRs、LILR、p75/AIRM1等)和C型凝集素样NK细胞受体(CD94/NKG2，NKG2D，NKp80，NKRP1等)。这些受体显著的特征是通过抑制或者激活而精确调节NK细胞的功能。 抑制性受体信号是通过胞质内的免疫受体酪氨酸抑制基序(ImmunoreceptorTyrosine-basedInhibitoryMotifs，ITIM)介导的。基于受体/配体间相互作用，ITIM募集特异性磷酸酶(SHP-1，-2)，酪氨酸被磷酸化，这将导致胞内激活级联反应的抑制。许多抑制性受体(KIR，CD94/NKG2，Ly49和LILR)可识别MHCI类分子，这些受体以同源分布型被所有NK细胞所表达；它们与HLAI类等位基因不同类别分子的相互作用使得正常细胞免于NK细胞溶解，这是由于此作用导致了自然细胞毒作用的抑制。NK淋巴细胞只杀伤那些转化为肿瘤或病毒感染细胞，已知它们部分地或全部地丧失了MHCI分子表达能力。这些观点基于经过小鼠和人类实验数据证实的“迷失自我(missingself)”假说。NK细胞不能溶解表达自身MHCI分子的正常组织，而NK细胞的触发通过非MHC限制性激活性受体介导来实现。 激活性受体通过偶连在胞内区包含免疫受体酪氨酸活化基序(ImmunoreceptorTyrosineActivatingMotifs，ITAM)的分子，如CD3ζ，FcεRIγ和DAP-12，来转导信号。而ITAM是通过磷酸化之后p72syk和ZAP70胞质PTK来实现转导活性信号的。NK细胞表达的能直接参与自然细胞毒作用的激活性受体，称为自然细胞毒受体(NCRs)，包括NKp46，NKp44和NKp30。 NCRs属于免疫球蛋白超家族(Ig-SF)，显示有一个或两个Ig-样胞外区，在跨膜区通过含有ITAM分子转导活化信号。特别说明的是，每个NCRs的交联都会导致三个结果：p56lck与p59fyn的激活、NCRs关联多肽的酪氨酸磷酸化以及p72syk和ZAP70胞质PTK的活化。“交互作用”功能的存在也得到近期发现的支持，单个NCR的结合能够活化信号转导途径，并介导其它NCR活化信号的放大。这些NK细胞所特有的表面受体，协同参与NK细胞激活作用，溶解靶细胞。 NKp30基因位于人类染色体6q21.32，编码30kD的糖蛋白，胞外区有1个IgV样结构域，在跨膜区与CD3ζ分子偶连。NKp30在人类静息及激活的NK细胞细胞表面均表达。NKp46编码基因位于人类染色体19q13.42，胞外区带有两个IgC2样结构域，并在跨膜区与CD3ζ和FcεRIγ连接，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，在人类静息及激活的NK细胞上均表达。NKp46基因存在于啮齿类动物(大鼠和小鼠)和灵长类动物，如黑猩猩和短尾猿中。 1999年，Cantoni等通过筛选人NK细胞cDNA文库，发现一种cDNA，它编码一种含有276个氨基酸的蛋白，定为NKp44。HUGO命名委员会将其命名为LY95。NKp44基因位于人类染色体6q21.1。像NKp46一样，NKp44是Ig-SF的一员，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白。此蛋白是以具有21个氨基酸的前导序列、169个氨基酸胞外区、23个氨基酸跨膜部分、63个氨基酸组成尾部胞内区为特征。编码蛋白胞外区带有1个IgV样结构域，而在跨膜区含有一个赖氨酸，通过跨膜区的赖氨酸与KARPAP/DAP12蛋白在跨膜区的天冬氨酸残基连接，实现了胞外区IgV样结构域在跨膜区与KARPAP/DAP12分子连接，并通过其免疫受体酪氨酸活化信号(ITAM)转导活化信号，其传导途径配体为ZAP70/Syk。胞内区包含ILYHTV氨基酸序列，是适合ITIM的序列。 NKp44在静息的NK细胞上不表达，但能选择性的表达在经IL-2诱导的NK细胞上。NKp44,像其它NCR一样，不结合经典MHCI类分子参与NK细胞激活作用。到目前为止NKp44的特异性配体尚不清楚；要进一步研究发现人NKp44的相关配体，需要认识NKp44细胞受体的结构及其识别特异性，从分子水平了解NK细胞生物学功能。本研究采用基因工程的方法构建了人NKp44表达载体，并获得纯化的重组蛋白，为人NKp44功能及相应细胞配体的研究奠定基础。 二、方法和结果 1.人NKp44基因克隆及序列分析 根据GenBank数据库报道人NKp44基因序列，设计扩增成熟人NKp44基因的两对引物，其中一对上、下游引物分别在5端加上限制性酶切位点NcoI和EcoRI，并且上游引物含有起始密码子ATG，同时加上保护性碱基TA，下游加上CG，降低G+C含量，防止二级结构的形成，提高重组蛋白质的表达含量。 取正常人新鲜外周静脉血，提取单个核细胞，5％CO237℃培养并加入IL-2进行诱导后收集细胞，用异硫氰酸胍一步法分离纯化细胞总RNA。以RNA为模板，随机六聚体核苷酸为引物，在M-MLV逆转录酶作用下进行反应，合成cDNA第一条链。 取逆转录产物为模板，以自行设计的两对引物，用TaqDNA聚合酶，进行巢式PCR扩增人NKp44基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后，与pMD18-T载体连接，转化入大肠杆菌DH5α，接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上。用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆。采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer基因分析仪进行测序，结果显示，克隆的基因和预期的成熟人NKp44基因完全一致，成功构建了NKp44重组质粒pMD18-T-hNKp44。 2.人NKp44基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的鉴定 用EcoRI和NcoI分别双酶切重组载体pMD18-T-NKp44和空载体pET30a(+)，再用1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化，获得目的基因片段NKp44DNA及质粒载体。利用DNA连接酶将基因片段NKp44DNA与酶切处理载体pET30a(+)连接，使其插入到T7lac启动子的下游，构建表达重组子pET30a(+)-hNKp44。 将连接产物转化入非表达载体大肠杆菌感受态细胞DH5α，然后接种于含有卡那霉素的LB培养平板上37℃过夜培养。利用菌落PCR，初步筛选阳性重组子。挑选阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养液37℃摇床过夜培养。采用树脂法小量提取质粒，然后用XbaI和EcoRI双酶切鉴定，确定定向插入的阳性克隆。 制备表达宿主菌株BL21(DE3)感受态细胞，然后用经无菌水稀释表达重组质粒1μl(约1ng)，转化入BL21(DE3)，接种于含有卡那霉素LB培养平板上，37℃过夜培养。从新鲜培养平板中挑取单克隆菌落，将含有pET30a(+)-NKp44的BL21(DE3)表达宿主菌株(工程菌株)接种于含卡那霉素的50mlLB培养液中，于37℃摇床培养约3小时，至对数增长期。加入诱导剂IPTG，继续诱导培养3-4小时，4℃4,000rpm5分钟离心收集菌体。 采用SDS-PAGE电泳和WesternBlotting分析重组蛋白质，用Bio-rad垂直电泳系统进行。AIphaInnotechAlphamagerTM2200凝胶图像扫描系统分析，凝胶干燥仪干燥后保存。结果显示，重组蛋白的表观分子量为35.4kD，和文献报道一致。重组蛋白约占菌体总蛋白的40％。 为研究重组NKp44的生物学活性，进行小规模的发酵。工程菌以1∶100接种于含Kan的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600约0.5，加入IPTG，继续培养4h。4℃离心收集菌体，超声破碎，离心分离上清和包涵体，进行SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白存在于包涵体中。在变性剂盐酸胍存在的条件下，利用His·Bind纯化试剂盒纯化重组蛋白，透析去除盐酸胍，PEG8000浓缩目的蛋白，并行SDS-PAGE电泳分析。 三、结论 1.成功克隆了人NKp44基因，序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道一致。 2.构建了成熟人NKp44的原核表达载体，获得稳定表达的工程菌株，表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的40％。 3.初步摸索优化了重组NKp44的表达条件。 4.获得纯化后的重组蛋白NKp44，纯度95％。