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研究背景：雷公藤甲素是从卫矛科雷公藤属植物中提取分离的三环氧二萜内酯类化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，具有抗炎、抗生育、免疫抑制等活性。近年的研究表明雷公藤甲素具有良好的抗肿瘤活性，能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。我们前期的实验结果表明雷公藤甲素具有抑制结肠癌细胞增殖和迁移的作用。本课题拟进一步研究雷公藤甲素的抗结肠癌分子机制，为雷公藤甲素的应用提供理论基础。目的：探讨雷公藤甲素对人结肠癌细胞HT29和SW480的增殖抑制作用及可能的分子机制。方法：第一部分：雷公藤甲素对HT29细胞和SW480细胞增殖、周期、凋亡的影响。采用MTT法和BrdU掺入实验观察雷公藤甲素对结肠癌细胞HT29和SW480的增殖抑制作用；雷公藤甲素作用24h后，采用流式细胞实验观察结肠癌细胞HT29和SW480周期和凋亡的变化；第二部分：分子机制研究1采用基因芯片技术检测雷公藤甲素对SW480细胞基因表达谱的影响，为研究雷公藤甲素的作用机制提供线索；2用Western blot法检测雷公藤甲素对增殖相关蛋白ERK1/2、MEK1/2、MEK1、AKT磷酸化水平的影响，用qPCR检测雷公藤甲素对ERK下游基因GABPαmRNA表达的影响，从而探讨雷公藤甲素抑制结肠癌细胞增殖的机制。3用Western blot法测定雷公藤甲素对HT29细胞和SW480细胞周期相关蛋白p21、p53、CDK2、p-CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin A1表达的影响；免疫共沉淀法观察雷公藤甲素对SW480细胞中p21与CDK4/CDK6的相互作用的影响，以此探讨雷公藤甲素诱导G1期阻滞的作用机制。4分别提取SW480细胞中的胞浆蛋白和胞核蛋白，Western blot法检测雷公藤甲素对胞浆和胞核中β-catenin表达水平的影响。采用qPCR法检测雷公藤甲素对SW480细胞β-catenin的基因CTNNB1及其下游靶基因LEF1和TCF7mRNA表达的影响，从而探讨雷公藤甲素对Wnt通路的影响。结果：1MTT结果表明：雷公藤甲素能够剂量/时间依赖性地抑制HT29和SW480细胞的增殖，且抑制作用强于5-FU和阿霉素。雷公藤甲素作用72h后，对HT29和SW480细胞的IC50分别为13.4nM和15.1nM。BrdU掺入实验再次确证雷公藤甲素的增殖抑制作用，给予150nM雷公藤甲素24h后，HT29和SW480细胞的BrdU阳性率显著降低(p<0.01)。流式细胞结果显示：雷公藤甲素能够诱导HT29和SW480细胞G1期阻滞，未发现其诱导凋亡作用。2基因芯片结果提示：雷公藤甲素作用24h后，196个基因上调，706个基因下调，通路分析发现下调基因主要涉及MAPK通路、周期通路、Wnt通路以及泛素化降解通路。Western blot结果显示雷公藤甲素显著抑制ERK和AKT的磷酸化，而对MEK1/2和MEK1的磷酸化水平没有影响，qPCR结果显示雷公藤甲素抑制ERK下游基因GABPα mRNA的表达，因此推测雷公藤甲素主要作用于ERK及其下游分子。Western blot结果没有观察到雷公藤甲素对CDK4、CDK6表达的影响，但是发现雷公藤甲素能够促进p21、cyclin D1、p53、CDK2的表达，抑制cylin A1的表达、抑制CDK2的磷酸化。免疫共沉淀结果显示雷公藤甲素促进p21与CDK4/CDK6结合形成复合物，因此我们推测雷公藤甲素通过上调p21表达阻断CDK4/CDK6的功能；下调cyclin A1的表达抑制细胞进入S期，进而导致细胞G1期阻滞。qPCR结果显示雷公藤甲素抑制β-catenin的基因CTNNB1以及下游靶基因LEF1/TCF7mRNA的表达，Western blot结果未观察到总蛋白中β-catenin表达变化。然而我们观察到胞核中β-catenin的表达降低。因此推测雷公藤甲素能够抑制β-catenin进入胞核，抑制LEF1/TCF7的表达，进而抑制细胞的转录和翻译，抑制细胞的增殖。结论：1雷公藤甲素可显著抑制结肠癌细胞增殖。2雷公藤甲素可能通过抑制ERK以及下游分子，抑制细胞增殖；通过上调p21表达，抑制cyclin A1表达诱导细胞G1期阻滞；通过抑制β-catenin进入细胞核影响Wnt通路。因此雷公藤甲素可能能够通过多个途径的共同作用抑制结肠癌细胞增殖。