鲇源拟态弧菌的分离鉴定研究

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shyibow
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2012年以来,四川各地南方鲇和沟鲇的养殖场常爆发一种以体表出现褪色斑,背部、腹部肌肉出现明显的长方状溃疡灶,臀鳍与尾鳍基部出血为特征的传染病。2012-2014年间,从四川各鲇鱼养殖区自然感染发病的南方鲇和沟鲇体内分离到4株(SCCF03-SCCF06)G-弧形,极生单鞭毛短杆菌。在TSA平板于28℃培养48h,形成表面光滑,边缘整齐,微隆起,乳白色的圆形菌落,在鉴别培养基TCBS上则形成绿色菌落。在光学显微镜下,4分离菌呈G-短杆菌,菌体稍弯,呈弧形或逗点状;电镜下可见菌体极生单鞭毛;生理生化特性与弧菌属细菌极为相似。根据分离菌株的形态学和生理生化特性初步判定其为弧菌(Vibrio sp); 16SrDNA与gyrB序列分析表明,4分离株16SrDNA序列(KC503057sKC503059、KJ001822、KF907127)与GenBank中V.cholerae 16S rDNA序列同源性最高;而gyrB序列(KC503058、KC503060、KC503054、KF998569)与V. mimicus gyrB序列同源性最高。在以分离菌16SrDNA序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,4分离菌与V. cholerae和V. mimicus聚为一族;在以gyrB基因序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,4分离株与V. mimicus聚为一族。在基于弧菌系统发育标志性鉴别基因dnaJ的双重PCR检测中,4分离株基因组DNA中均特异性扩增出大小约为177 bp条带,与预期V. mimicus扩增片段一致,进而鉴定4株分离菌为V. mimicus。药物敏感性实验结果显示4株V. mimicus对链霉素、丁胺卡那、氟哌酸、氟苯尼考和氧氟沙星等抗菌药物敏感,对青霉素和罗红霉素等耐药。病理学观察发现,V. mimicus感染鲇鱼对多组织器官都造成明显的病理损伤,尤其是肌肉、肝、脾、肾的损伤较为严重,表现为明显的出血、变性和坏死以及炎症细胞浸润等。对分离的4株V. mimicus的多种毒力基因txA、zot、ace、tcpA、toxR、ompU和vmh进行检测,结果显示鲇源V. mimicus都携有ompU和vmh两种毒力因子,而不具有txA、zot、ace、 tcpA和toxR。以SCCF06菌株为研究对象,对其vmh基因全序列进行PCR扩增、克隆并测序,应用生物信息学软件分析vmh基因的同源性及其编码氨基酸的分子特征。结果显示,本研对vmh基因全长序2235 bp,编码744个氨基酸残基组成的分子量约为82.85 kDa的蛋白,富含Ser(8.6%)、Ala(7.9%)和Leu(7.7%),包含Hemolysin_N、RICIN、Leukocidin和Jaclin_like超家族的保守结构域。多序列比对显示,vmh基因的核苷酸序列和氨基酸序列与GenBank中参考株相应序列的同源性分别介于95%-97%和96%-97%。其编码的氨基酸序列在N端前25个氨基酸形成一个信号肽,7-27位氨基酸之间存在一个跨膜区,疏水性大于亲水性;抗原表位和B细胞表位预测显示其编码的蛋白具有良好的抗原性;修饰位点预测显示,存在44个潜在的磷酸化位点,9个潜在的N-糖基化位点和8个潜在的O-糖基化位点。
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