前言：　　肺癌一直都是全球范围内高死亡率的恶性肿瘤，根据统计数据，每年215，000患癌病人中，有160，000死亡，而肺癌致死率一直位居榜首，并且死者中80％为非小细胞肺癌患者。肿瘤的发生、发展过程中细胞生长增殖及运动能力等多方面发生调控紊乱，并涉及多种调节因子的作用。寻找上述过程中发挥关键作用的活性分子，阐明其表达意义，揭示其发挥调控作用的分子机制将有助于临床对肺癌的诊断及治疗。　　人F11R(F11 receptor)属于免疫球蛋白超家族，表达于上皮及内皮细胞并主要定位于细胞间连接处，还广泛表达于循环血液中的中性粒细胞，单核细胞，血小板及淋巴细胞中，广泛参与到调控上皮细胞及内皮细胞运动，白细胞游走，血小板活化，维持细胞屏障完整性，介导病毒感染等多种生物学活动中。F11R发挥调控作用与其蛋白二聚体的形成以及胞内段PDZ结合基序介导的信号转导过程密切相关。　　近年来，陆续发现F11R在不同肿瘤中表达并发挥生物学作用，但基于不同肿瘤病例，不同细胞系及实验条件所报道的F11R对肿瘤的调控结果及机制不同，甚至存在矛盾。对子宫内膜癌，前列腺癌，肾癌及部分乳腺癌的组织病理学及细胞学研究结果显示F11R低表达与肿瘤细胞侵袭运动能力，肿瘤级别、分期及不良预后等指标正相关。与之相反，另一部分涉及乳腺癌、子宫内膜癌的组织病理学，细胞学研究及基于miro RNA及F11R单克隆抗体的相关研究结果则与之相反。而F11R在肺癌组织中表达情况，临床意义及生物学机制目前尚无详细报道。　　本研究检测并分析了F11R在肺癌组织中的表达情况及其与临床病理指标及愈后生存情况之间的关系，以期发现F11R在肺癌发生发展过程中的作用及意义。同时，我们采用分子细胞学研究手段，检测了F11R在肺癌细胞系中的表达情况，通过SiRNA干扰F11R的表达，对比分析F11P对于肺癌细胞增殖及运动能力的调控作用，并深入探讨其发挥调控作用的机制。　　材料与方法：　　一、NSCLC病人及组织样品　　82例非小细胞肺癌(NSCLC)为2002年至2009年辽宁省肿瘤医院收治的病人，其中49例为回顾性肺癌病例。本研究中所有病人术前未接受任何放、化疗治疗。非小细胞肺癌病理诊断、组织学分级、淋巴结转移、临床病理分期由两位副高职病理诊断医师根据WHO标准和Frank的报道重新筛选[1]。常规病理检查手术切除的肺门、纵膈以及肺内淋巴结，用于确定肺癌的淋巴结转移情况。患者的临床病理资料包括性别，年龄，肿瘤体积，组织学类型，组织学分级，淋巴结转移，摘自患者的病历资料。82例非小细胞肺癌包括:男性38例，女性44例;年龄40～78岁（中位年龄59岁）;肿瘤体积0.5cm-8cm(中位数3.5cm);鳞癌36例，腺癌46例;组织学分级:高-中分化38例，低分化44例;淋巴结转移31例，无淋巴结转移51例;临床病理分期(pTNM)中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分别为45例、30例和17例。49例回顾性非小细胞肺癌病人随访截止时间2009年12月31日，中位随访时间43.5个月，死亡49例，存活0例。　　二、免疫组织化学方法染色　　1、所有手术切除标本经10％中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋。制作4μm厚连续切片，并贴于涂有0.5％多聚赖氨酸处理的载玻片备用，70℃烤箱8小时，所有切片均在同一实验室采用同一批号试剂完成免疫组织化学染色。每份标本常规HE染色，光镜下进行组织形态观察及分化程度判断。免疫组织化学染色诊断采用ElivisionTM plus Polyer HRP两步法，具体流程如下:将切片用2甲苯脱蜡，梯度酒精水化，进行抗原修复（pH9.0 EDTA加热20分钟），3％H2O2阻断内源性过氧化物酶，非免疫山羊血清阻断非特异性结合，F11R一抗(1∶100)4℃孵育过夜，Evision A液、B液37℃各孵育15分钟，DAB显色，苏木素复染核，自来水返蓝，常规梯度酒精脱水，2甲苯透明，封片观察。　　三、细胞系和细胞培养　　冻存于液氮的人肺癌细胞系SPC-A-1(SPC)，H1299，A549，LK2，H460，H157，HBE经复苏后，用DMEM(含有10％新生牛血清)或1640培养液（含有10％新生牛血清，100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素），在37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，经3次传代稳定后，进行转染。　　四、细胞瞬时转染SiRNA干扰　　胰酶消化对数生长期细胞，计数并调整细胞数量接种于6孔培养板中，使次日转染前细胞达90％融合。转染当日，培养孔更换1.5ml正常培养基（含有10％胎牛血清），每孔用250ul无血清MEM培养基混合5ul F11R SiRNA或SiNC室温静置，另外用250ul无血清MEM培养基混合2ul lipofectamine2000转染试剂，室温静置5min，将上述两种混合液轻轻混合均匀，室温静置20min，滴加入培养孔中，轻摇孔板混匀转染试剂并放回培养箱中继续培养，分别于48h、72h后终止培养提取RNA及蛋白。　　五、细胞总RNA抽提　　六孔板培养细胞，细胞密度达约100％融合时，每孔加入1.0ml Trizol reagent,充分裂解10分钟;4℃，12000rpm离心15min:取上清于新的EP管中，加入200ul氯仿，涡旋混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm离心15min;取上层清亮液体于另一新的EP管中，加入等体积异丙醇，轻摇混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm离心15min;弃掉液体，分别已75％乙醇和100％乙醇洗涤2次，4℃，12000rpm离心10min，吸去液体，室温干燥;40ml RNase-free H2O溶解沉淀，分装储存于-70℃备用。3ul总RNA样品，读取其在NanoDrop ND-1000 spectrophotometer(Wilmington,USA)260nm和280nm的吸收值;1.5％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，检测RNA28s/18s条带完整性。只有符合OD=1.8-2.0和28s/18s＞1的样品应用于本研究。　　六、realtime RT-PCR　　mRNA定量检测采用SYBR Green realtime RT-PCR方法。利用PrimeScript TMRT Master Mix(Takara，日本)合成特异性的cDNA，反应体系10ul，在基因扩增仪（G-Storm，英国）内经如下循环完成反转录过程:37℃，15min;85℃，5sec;4℃贮存，次日扩增待用，或-20℃贮存，30天内待用。realtime RT-PCR在AppliedBiosystems7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)内完成。F11R的引物为5-GTGAAGTTGTCCTGTGCCTACTC-3(forward)和5-ACCAGT TGG CAAGAAGGTCACC-3(reverse).Cyclin D1引物序列为:5-TCT ACACCGACAACTCCATCCG-3(forward)和5-TCT GGC ATT TTG GAG AGG AAGTG-3(reverse).β-actin引物序歹为5-CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTTC-3(forward)和5-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3(reverse)PCR反应体系20ul，反应条件:90℃15s，90℃5s，60℃30s，以上40个循环。β-actin作为内参对照。实验组及对照组均设2次重复。采用相对定量的方法，2-ΔΔCt进行比较。　　七、Western blot检测　　提取转染后72h各组细胞蛋白，根据蛋白的分子量制备10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量60μg，常规电泳、转膜、封闭，一抗4℃过夜孵育，相应HRP-羊抗兔IgG二抗室温孵育2h，GAPDH作为内对照。Western Lightning(@)-ECL，Enhanced Chemiluminescence Substrate(Perkin Elmer, NEL100001EA)检测，显影。UVP图像处理系统采集图像，ImageJ灰度分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度。分别计算不同指标和GAPDH的INT×S，用二者的比值显示不同指标的表达水平。　　八、MTT实验　　细胞转染48h后，胰酶消化制成单细胞悬液，以3×103个/100ul密度接种于96孔培养板中，每孔100ul，每种细胞重复接种6孔，另设相同数量无细胞对照孔，只加入相应培养基，共铺种细胞5板。于次日起，每日取一培养板，弃原培养基，避光操作，每孔加入120ul混有20ulMTT的无血清培养基，放回细胞培养箱继续培养4h，小心吸弃原培养基，每孔加入DMSO150ul，避光震荡10min，酶联免疫检测仪检测各孔490nm光吸收值，以时间为横轴，每组细胞光吸收平均值与对照孔平均值之差为纵轴绘制细胞生长曲线。　　九、集落形成实验　　细胞转染48h后，胰酶消化制成单细胞悬液，以1×103个/2000ul密度接种于96孔培养板中，每2000ul，连续培养12-15天，于单个细胞克隆中细胞数超过50个时停止培养，甲醇固定，苏木素染色液，干燥后，拍照计数集落形成数量。　　十、划痕实验　　细胞转染48h后，弃原培养基，采用含10uM丝裂霉素的无血清MEM培养基培养2h抑制细胞分裂，之后弃MEM培养基，采用高压消毒处理的200ul Tip垂直于培养板在细胞层划痕，PBS溶液洗涤5次，加入含10％胎牛血清的正常培养基，拍照纪录划痕形态，记为0h，将培养板放回培养箱继续培养。之后分别于12h，24h，48h取出培养板，PBS溶液洗涤5次，更换新培养基，进行拍照记录观测划痕愈合情况。每种细胞分别于划痕三处固定位置平行观测记录。　　十一、流式细胞技术检测周期　　细胞种植于六孔培养板中待贴壁后，采用无血清培养基饥饿培养24h使细胞周期同步化，更换正常培养基并转染SiRNA继续培养72h，弃原培养基，4℃预冷PBS洗涤2次，每孔600ul胰酶37℃消化5-10min，加入600ul培养基终止消化，轻柔吹打细胞制成单细胞悬液移入EP管中，1200r/5min离心，弃上清，加入1mlPBS重悬细胞，1200r/5min离心，弃上清，75％乙醇固定4℃过夜，1300r/5min离心，弃上清，加入300ulPI重悬细胞，流式细胞仪分析细胞周期。　　十二、统计学分析　　计量数据以用mean±SD表示，数据采用t检验或X2进行统计分析，Kaplan-Meier单因素分析进行生存时间分析，mRNA相对表达水平以2-ΔΔCt进行比较，所有统计数据均应用SPSS17.0进行分析，p＜0.05有统计学意义。　　实验结果：　　一、F11R在肺及肺癌组织中的表达　　免疫组织化学染色显示，F11R在癌旁肺泡及支气管上皮细胞的细胞膜及细胞浆中弱表达，在肺腺癌及鳞癌细胞中主要表达于细胞膜，胞浆亦可见少量表达，F11R膜高表达同肺癌临床病理分期(P=0.021)，局部淋巴结转移(P=0.007)正相关，同愈后生存率负相关（Log-Rankp=0.02）　　二、F11R在非小细胞肺癌细胞系中的表达　　H1299，A549中F11R表达水平最高，高于HBE近1倍以上，而SPC，LK2，H157，H460表达水平均低于HBE，故选用H1299，A549进一步实验。　　三、F11R高表达肺癌细胞系瞬时转染SiRNA干扰F11R表达　　在H1299，A549细胞瞬时转染SiRNA干扰F11R表达72h后，经Western blot检测，F11R蛋白表达水平较转染SiNC对照组明显下降　　四、F11R调控肺癌细胞增殖能力　　H1299，A549两种肺癌细胞系在干扰F11R表达后，经MTT实验检测发现H1299(p＜0.001)，A549(p＜0.001)增殖能力明显下降。同时进行的集落形成实验也显示干扰F11R表达后H1299(p＜0.01)，A549(p＜0.01)细胞集落形成数量明显下降。　　五、干扰F11R阻滞细胞周期于G1期　　经PI染色，流式细胞仪检测，发现干扰F11R之后G1期细胞增多(H1299,Negative Control vs JAM-A siRNA,57.8±2.8 vs68.1±2.5,p＜0.01;A549 NegativeControl vs JAM-A siRNA，57.12±2.77 vs65.96.1±2.52，p＜0.05），而S期细胞减少(H1299, Negative Control vs JAM-A siRNA,30.49±2.8 vs24.1±2.74, p＜0.05; A549Negative Control vs JAM-A siRNA,29.33±2.61 vs23.49.1±2.49, p＜0.05)。　　六、干扰F11R影响细胞周期调控蛋白的表达　　经SiRNA干扰下调F11R表达后，经Western blot实验检测发现，H1299，A549细胞中Cyclin D1，CDK4，CDK6，p-Rb蛋白表达明显减少，而Cyclin A，Cyclin B，p21，p27表达水平未见明确变化，realtime RT-PCR检测发现Cyclin D1 mRNA与转染对照组相比较明显下降。　　七、干扰F11R抑制肺癌细胞运动能力　　经SiRNA干扰下调F11R表达后，采用划痕试验检测细胞运动能力变化情况，发现H1299(Wound area(％of Oh)，SiNC vs SiF11R，0 vs0.3±0.062，p＜0.01），A549(Wound area(％of Oh) SiNC vs SiF11R，0 vs0.29±0.046，p＜0.01）划痕愈合能力下降。　　八、F11R通过调控Rho B影响肺癌细胞运动能力　　经Western blot检验发现，干扰F11R之后，H1299，A549细胞中RhoB蛋白表达水平增加，RhoA，RhoC，E-cadherin，N-cadherin，Integrinβ1蛋白表达水平无明显变化，同时，经realtime RT-PCR检测发现，RhoB mRNA增多。　　九、F11R调控p38 MAPK信号通路　　经Western blot检验发现，干扰F11R之后，总p38 MAPK表达未见改变，而磷酸化p38 MAPK（P38 MAPK-p）蛋白表达水平相对增加。AKT1/2，磷酸化AKT(AKT-p)，ERK，磷酸化ERK（ERK-p），JNK，磷酸化JNK(JNK-p)表达水平未见变化。　　结论:　　1、F11R在NSCLC组织中存在表达，肿瘤细胞膜F11R高表达与肺癌病理分期，局部淋巴结转移正相关，与患者愈后生存率呈负相关。　　2、F11R通过调控Cyclin D1，CDK4，CDK6及p-Rb表达，控制肺癌细胞增殖。　　3、F11R通过调控RhoB表达，进而控制肺癌细胞运动能力。　　4、F11R调控p38 MAPK磷酸化水平，并可能借此途径调控Cyclin D1，CDK4，CDK6，p-Rb及RhoB表达。