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棉花角斑病菌Xanthomonas citri subsp.malvacearum(Xcm)可以引起棉花角斑病,由于Xcm可能存在限制性修饰系统,导致外源基因难于被转化,因而对Xcm进行遗传转化仍是一件困难的工作。本研究采用驯化野生菌株或重组质粒的方法,突破了限制Xcm成功电转化的障碍,建立一套适用Xcm的高效基因缺失突变系统,为Xcm未知基因的功能以及其他难转化细菌的研究提供了科学依据。hpaXm是本实验室从Xcm基因组中扩增出编码HpaXm蛋白的hrp基因,并通过信号肽预测软件预测出hpaXm基因的前45bp可能为潜在的信号肽类似序列,命名为hpaXm-IP。本研究以Xcm的18号小种(V8)为标靶菌株,hpaXm和hpaXm-IP为靶基因,来验证Xcm遗传驯化的成功性。(1)敲除载体构建成功我们从V8菌株基因组中通过PCR分别扩增出两条靶基因的左右同源臂,利用融合 PCR 构建了hpaXm-IP 和hpaXm 基因的敲除载体 pK18mobsacB::N1012 和pK18mobsacB::m762。结果显示:pK18mobsacB::N1012 双酶切能够切出约 1000bp 的单一条带,与hpaXm-IP基因融合的同源臂hpaXm-IP-(L+R)条带大小基本一致;测序结果在NCBI里比对发现,碱基序列与hpaXm-IP-(L+R)基因完全一致,无碱基错配,说明pK18mobsacB::N1012构建成功。pK18mobsacB::m762双酶切能够切出约800bp的单一条带,与hpaXm基因融合的同源臂hpaXm-(L+R)大小基本一致;测序结果在NCBI里比对发现,碱基序列与hpaXm-(L+R)基因完全一致,无碱基错配,说明pK18mobsacB::m762 构建成功。(2)菌株和质粒驯化成功菌株驯化:在不断增大氮胞苷筛选浓度下,在含有氮胞苷的NA平板上接种V8菌株,逐代驯化、挑取每一代长出的单菌落制备感受态细胞进行电转化,直至得到抗100 μM氮胞苷的限制修饰系统突变菌株V8,结果显示每次转化均能获得3-20个单克隆。质粒驯化:利用超声波破碎提取V8菌株含有甲基化酶的无细胞胞外提取物(CFEs),将CFEs和重组质粒于S-腺苷甲硫氨酸溶液(SAM)中37 ℃,10h,随后将得到的上清液用苯酚:氯仿:异戊醇混合物抽提,无水乙醇沉淀后,经TE缓冲液溶解的沉淀即为驯化后的重组质粒,每次电转化能够得到1-5个单克隆。突变体的验证:未经菌株或者质粒驯化时,平板上不会长出任何单克隆,经过驯化后,平板上能够长出丰满、隆起且具黄色光泽的单克隆,初步推测重组质粒已经电转化进入V8菌株。利用目的基因及其融合同源臂的扩增引物PCR和测序验证发现:pK18mobsacB::m762电转化V8菌株得到的单克隆,仅能扩增出约800 bp的单一条带且不能扩增出目的条带hpaXm基因,相反野生菌株不仅能够扩增出约1000bp的单一条带,而且还能扩增出约400 bp的目的条带;测序结果发现单克隆中目的基因完全缺失,说明得到了hpaX 基因缺失突变菌株,命名为V8Δ hpaXm。pK18mobsacB::N1012电转化V8菌株得到的单克隆,通过PCR和测序结果显示缺失的目的基因仅45 bp,说明得到了信号肽类似序列缺失突变菌,命名为V8ΔhpaXm-IP。(3)V8菌株最适电转化条件的摸索虽然通过驯化已经成功对V8菌株实现遗传转化,且菌株驯化的效率是质粒驯化的10-100倍,但是电转化效率依然较低,为了使V8菌株的突变系统更加高效,本实验对影响V8菌株电转化效率的因素如:细胞生长状态、电压强度、质粒浓度及用量、复苏方式及时间、复苏培养基种类及温度等进行逐一研究,结果表明:当选取对数中期的V8菌株制备感受态细胞、电压2.1 kv、7μL浓度50 μg/mL左右的质粒、4℃预冷的复苏培养基SOC、振荡复苏培养4-5 h时,电转化效率会达到约5×102/μg DNA。(4)突变菌株生物学特性将供试菌株进行平板生长实验,发现:hpaXm基因和信号肽类似序列hpaXm-IP的缺失不影响V8胞外多糖、纤维素酶和胞外脂酶的活性,但降低了胞外淀粉酶的活性;V8菌株没有产生胞外蛋白酶的能力,hpaXm基因和信号肽类似序列hpaXm-IP的缺失也不影响V8菌株这方面的功能。绘制供试菌株在NB中的生长曲线发现,hpaXm基因和信号肽类似序列hpaXm-IP缺失使得V8的生长能力降低了。烟草过敏反应显示:V8菌株、突变菌株V8ΔhpaXm和V8ΔhpaXm-IP在烟草上均能形成坏死斑,但两个突变株形成坏死斑面积相比野生菌株变小了,初步推测:信号肽类似序列可能具有牵引HpaXm蛋白泌出的能力,并且HpaXm蛋白不是V8中唯一激发HR的活性物质,或可能hpaXm基因和信号肽类似序列hpaXm-IP的缺失影响V8菌株的致病性,但不是必需的。