论文部分内容阅读
肥胖的发生与脂肪组织过度增殖和分化有关，脂肪细胞的分化过程中存在复杂网络调控。Chemerin/CMKLR1信号通路、Wnt/-catenin信号通路和TNF-α共同参与成脂分化过程。敲低chemerin后成脂分化过程被抑制，说明chemerin在成脂分化过程中起关键作用，但其作用机制尚未见报道。激活Wnt/-catenin信号通路可以通过抑制成脂关键分子PPARγ的表达抑制成脂。研究表明，添加外源chemerin全蛋白（1μg/ml）可降低骨骼肌细胞GSK-3的磷酸化水平。GSK-3是-catenin降解复合物的组成分子，而-catenin是Wnt/-catenin信号通路的关键分子。我们猜测在成脂分化过程中，chemerin与Wnt/-catenin信号通路存在串话。脂肪细胞因子TNF-α也参与成脂分化过程，对前脂肪细胞的分化起抑制作用。其与chemerin/CMKLR1信号通路、Wnt/-catenin信号通路密切相关。本实验利用实验室现有野生型（WT）、TNF-α缺失(TNF-α-/-)、瘦素受体基因突变(Leprdb/db，db/db）以及瘦素受体和TNF-α双基因突变（DT）小鼠，从其腹股沟处内脏白色脂肪组织中分离脂肪干细胞（ADSCs）进行原代培养，于成脂诱导的同时添加chemerin149-157寡肽（C9）处理细胞，在成脂诱导的4个不同时期（诱导前I0、诱导早期I3、诱导中期I7、诱导后期I14）固定细胞、抽提细胞总RNA以及抽提细胞总蛋白，分别从形态学、靶基因的转录和翻译水平上探究C9对不同基因型小鼠原代ADSCs成脂分化中Wnt/-catenin信号通路的影响。（1）通过人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMCs)迁移、NIH3T3细胞增殖及WT小鼠原代ADSCs蛋白免疫印迹检测ERK磷酸化水平实验，证明添加的C9寡肽对于促进HA-VSMCs迁移、促进NIH3T3细胞增殖以及提高WT小鼠原代ADSCs ERK蛋白磷酸化水平具有生物学活性，10nM是其最佳效应浓度。（2）形态学观察发现，四种不同基因型小鼠ADSCs成脂率高低顺序为TNF-α-/-小鼠>WT小鼠>DT小鼠>Leprdb/db小鼠；C9对四种基因型小鼠ADSCs成脂分化的成脂率、脂滴大小和脂滴出现的时间均无显著影响。（3）针对靶基因转录水平的检测发现：与非处理组相比，C9处理组四种基因型小鼠ADSCs成脂标志分子PPARγ2、adiponectin、C/EBPα和C/EBP的mRNA水平无显著差异（p>0.05）；Wnt/-catenin信号通路关键分子如Wnt10b、-catenin的mRNA水平，在处理组和非处理组之间，也无显著差异（p>0.05）。（4）针对靶基因翻译水平的检测发现：与非处理组相比，C9处理组的四种基因型小鼠ADSCs的adiponectin水平无显著差异（p>0.05），Wnt/-catenin信号通路关键分子-catenin蛋白水平显著下调（p<0.05）。以上实验结果表明，添加外源C9对四种不同基因型小鼠ADSCs成脂分化的成脂率、脂滴大小、脂滴出现时间，成脂相关分子PPARγ2、adiponectin、C/EBPα和C/EBP的mRNA水平，成脂相关分子adiponectin的蛋白水平，均无显著影响。另外，添加外源C9对四种不同基因型小鼠ADSCs成脂分化中Wnt/-catenin信号通路关键分子Wnt10b和-catenin的RNA水平无显著影响（p>0.05），然而其可显著降低-catenin的蛋白水平，说明C9的作用是可以促进-catenin蛋白的磷酸化降解。由此猜测C9可以通过促进-catenin蛋白的磷酸化降解与Wnt/-catenin信号通路发生串话。另外，TNF-α缺失可以减弱C9对-catenin蛋白的磷酸化降解作用，瘦素受体缺失引起的肥胖可以促进C9对-catenin蛋白的磷酸化降解作用，其作用机制还需进一步研究探讨。