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大葱(Allium fistulosum)起源于我国,是中、日、韩等东亚国家的传统蔬菜和调味品。蜡质是植物最外层的多种有机混合物总称,由不同碳链长度的长链脂肪酸及烷烃、醇、醛、羧酸等衍生物组成,形成一层疏水的保护层,普遍存在于陆生植物地上部器官的表层、受伤的组织和木栓质中。植物表皮蜡质可以防止植株内部组织中水分发生非气孔性散失,并且能够阻止植物被有害光线损伤,具有避免病菌侵害等功能,在降低外界胁迫对于植物的影响上具有一定作用。同时,植物表皮蜡质同植物对昆虫的吸引及排斥反应相关联。大葱表皮蜡质的合成与运输受一系列酶以及与酶合成调控相关的基因所调控,具有复杂的分子机制。目前,在拟南芥、玉米等常被研究的植物中,蜡质合成的有关基因已有研究,调控网络已经大致清晰。通过对本课题前期少蜡突变体glbg转录组测序结果的分析发现,在大葱少蜡突变体中,Af CER2-LIKE1基因发生单碱基突变,推测其移码突变导致大葱少蜡突变体产生。大葱中已对蜡质合成的有关基因Af KCS6的功能有了初步的了解,研究表明Af KCS6在蜡质合成代谢过程中,可能主要促进合成长链脂肪酸及烷烃、醇、醛等的合成,对酯类的合成形成起到间接抑制的作用,在睡莲、水稻等植物中已证实了KCS6与CER2-LIKEs两基因间存在互作关系,调控蜡质合成与运输,但Af CER2-LIKE1基因调控大葱表皮蜡质合成代谢的分子机制尚不清楚,其与Af KCS6蛋白间是否存在互作关系仍有待研究。本研究为明确Af CER2-LIKE1基因功能,首先运用生物信息学技术对该基因进行分析,了解其理化性质;其次通过亚细胞定位技术,明确Af CER2-LIKE1基因在细胞中的表达部位;最后利用酵母双杂交技术、双荧光素酶报告基因系统实验以及双分子荧光互补技术研究Af CER2-LIKE1与Af KCS6蛋白间的互作关系,本研究主要结果如下:(1)以鞭杆大葱bg的c DNA为模板克隆了Af CER2-LIKE1基因,该基因CDS序列全长为1260 bp,推测编码419个氨基酸,通过对氨基酸序列进行多重比对分析发现Af CER2-LIKE1存在HXXXD基序,BLASTp比对结果表明Af CER2-LIKE1与石刁柏、菠萝的同源性大于50%,系统发育树分析显示,Af CER2-LIKE1与Ao CER26-LIKE(石刁柏)位于同一分支上,二者间亲缘关系最为相近;(2)利用亚细胞定位技术,采用聚乙二醇诱导法转化烟草原生质体细胞,通过共聚焦显微镜进行观察发现Af CER2-LIKE1定位于细胞质中;(3)运用酵母双杂交技术,将Af KCS6与Af CER2-LIKE1基因CDS全长分别构建于实验所需的p GBKT7载体和p GADT7载体中,随后共同转化到Y2HGold酵母菌株中,试验结果表明,在酵母中鞭杆大葱bg Af KCS6与Af CER2-LIKE1可以相互作用,少蜡突变体glbg中Af KCS6与Af CER2-LIKE1在酵母细胞中无互作关系;(4)通过双分子荧光互补技术,将Af KCS6与Af CER2-LIKE1分别亚克隆至p SAT6-c EYFP-C1和p SAT6-n EYFP-C1载体中,而后采用PEG诱导转化法将二者共转化至本氏烟草原生质体中,经荧光共聚焦显微镜进行观察,结果显示以鞭杆大葱bg为材料时,Af KCS6与Af CER2-LIKE1可在烟草原生质体中观察到荧光信号,在植物体内存在互作关系,而以少蜡突变体glbg为材料时,原生质体中无法检测到荧光信号,两蛋白间无互作关系;(5)通过双荧光素酶报告基因系统,将Af KCS6与Af CER2-LIKE1分别亚克隆至p CAMBIA-n LUC和p CAMBIA-c LUC载体中,注射器注射法将农杆菌注射至本氏烟草叶片背面,后通过植物活体成像系统观察结果,鞭杆大葱bg实验组中可观察到较强的荧光信号,glbg中无荧光信号,通过观察荧光信号的有无从而判断蛋白间互作与否,进一步证明了Af KCS6与Af CER2-LIKE1在植物体内表现为互作关系。