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胰岛素和运动均促使葡萄糖转运子4转位到细胞膜上,转运更多的葡萄糖进入细胞而调节细胞的葡萄糖摄取量。相对于胰岛素,对运动／肌肉收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖的机制了解较少。目前研究运动／肌肉收缩多应用转基因动物,费用昂贵,而且不能应用基因沉默等技术。而培养的细胞株则没有诸多限制,可单独分析细胞内信号转导,排除血液循环成分和血液动力学因素的影响,更好地理解锻炼如何改善胰岛素作用。目前广泛应用的L6骨骼肌细胞不具收缩能力。具收缩能力的C2C12骨骼肌细胞仅表达少量的GLUT4,使得运动调节葡萄糖转运的研究,因缺少合适的肌肉模型而受到限制。本研究的目的是建立C2C12GLUT4myc细胞株,并应用此细胞模型探讨运动／肌肉收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4运输的机制。研究内容和方法：第一部分建立C2C12GLUT4myc细胞株；检测分化能力和GLUT4myc的表达量,确定分化能力强并高表达GLUT4myc的细胞株。与L6GLUT4myc比较膜蛋白和信号分子以及GLUT1的表达；免疫荧光检测GLUT4myc在细胞中的定位；测定此细胞响应胰岛素刺激的GLUT4转位的时间曲线和剂量曲线。第二部分比较carbachol、AICAR和胰岛素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖摄取和GLUT4转位,并观察三种刺激物作用的叠加性。通过使用各种信号蛋白的抑制剂,分析刺激GLUT4转位的信号机制。第三部分比较三种刺激物对信号分子的作用,检测信号分子的活性。结果：建立了C2C12GLUT4myc细胞株,GLUT4myc的表达量与L6GLUT4myc中的GLUT4myc量接近,约为小鼠骨骼肌GLUT4的10倍。C2C12GLUT4myc细胞表达IRAP和TfR的量高于L6GLUT4myc, VAMP2和VAMP7的表达在两种细胞中接近。C2C12GLUT4myc细胞表达AS160、AMPKα2和GLUT1高于L6GLUT4myc细胞,而Akt1和Akt2的表达则低于L6GLUT4myc。两种细胞表达AMPKα1、Akt3和PKC的量相近。GLUT4myc主要分布于细胞核周围。C2C12GLUT4myc细胞的葡萄糖摄取和GLUT4转位对胰岛素的作用呈剂量和时间依赖关系,最大值为基础状态的1.63±0.05倍。比较carbachol、AICAR和胰岛素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖摄取和GLUT4转位,并观察三种刺激物作用的叠加性的结果显示,carbachol刺激葡萄糖摄取和增加细胞表面GLUT4myc含量,使之分别增加为基础组的1.60±0.08倍和1.77±0.08倍。胰岛素使葡萄糖摄取和细胞膜上GLUT4myc分别增加1.55±0.02倍和1.63±0.05倍。AICAR使葡萄糖摄取和GLUT4转位分别增加1.63±0.11倍和1.84±0.11倍。三种刺激物的作用均具有叠加性。胰岛素和carbachol一起孵育使GLUT4myc细胞转位增加2.57±0.30倍。胰岛素和AICAR一起孵育使GLUT4myc转位增加2.80±0.30倍。Carbachol和AICAR一起孵育使GLUT4myc转位增加2.95±0.38倍。LY294002不能抑制carbachol刺激的GLUT4myc转位,但此作用可被Compound C抑制85%。BTS可抑制57%的carbachol刺激的GLUT4myc转位。Compound C抑制84%AICAR刺激的GLUT4myc转位,但不影响基础和胰岛素作用下的细胞膜上的GLUT4myc水平。BIM和KN93均抑制carbachol刺激的GLUT4myc转位。比较三种刺激物对信号分子的作用的结果显示,carbachol和AICAR激活AMPK; Compound C抑制carbachol和AICAR刺激的AMPK磷酸化。carbachol不能诱导Akt的磷酸化,但增加Rab-GAP,AS160Thr642的磷酸化。结论：1.可收缩的C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞的GLUT4myc转位对胰岛素作用呈剂量和时间依赖关系；细胞响应carbachol刺激的收缩作用,GLUT4转位到细胞膜并摄取葡萄糖。2. L6GLUT4myc和C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞分别高表达胰岛素关键信号分子Akt2和运动关键信号分子AMPKa2,提示此两种细胞株可分别用于研究胰岛素作用和运动／肌肉收缩作用的细胞模型。3. Carbachol去极化诱发的收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4转位和葡萄糖摄取,其信号转导机制不同于胰岛素和AICAR,参与的信号分子可能涉及LKB1、AMPK. CaMKⅡ和PKC。肌肉收缩可替代胰岛素促进骨骼肌摄取葡萄糖。4.胰岛素、AICAR和carbachol三种刺激物的信号途径汇聚在AS160。本课题建立了可用于研究肌肉收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖机制的细胞模型,可用于筛查抗糖尿病药物。并探讨了收缩刺激GLUT4转位的信号转导机制,可为药物研发提供作用靶点,并有助于临床干预、改善胰岛素抵抗。