红茶是世界上消费区域最广、生产量最多、国际贸易量最大的茶类。中国是红茶生产的发源地,早在16世纪就发明了红茶;按照加工方法的不同,红茶可分为功夫红茶、红碎茶和小种红茶。不同种类的红茶尽管对加工工艺的要求不同,但都是以适宜的茶树新芽叶为原料,经萎凋、揉捻(切)、发酵和干燥四道基本工序加工得到的。红茶品质组成非常复杂,通常主要包括挥发性香气成分、糖类、有机酸、氨基酸、多酚类、生物碱及其在加工过程的转化成分等,其形成与加工过程及其工艺要求密切相关。代谢组学是20世纪90年代中期发展起来的一门组学研究新技术,代谢组学技术通过对大量代谢物进行定性定量分析,可根据相关联的代谢物组分和含量的变化,推测相应的代谢途径和代谢网络,以揭示茶多酚、生物碱、氨基酸、黄酮、香气物质等主要特征品质成分在红茶加工过程中的形成、转化及其相互关系的本质规律,是研究和阐明红茶品质形成机理的良好技术平台。本论文以分别于2013年5月和6月采摘的两批茶鲜叶为初始原料,采用传统祁门红茶加工方法进行加工,通过专业的茶叶感官审评,选取成茶品质较优的第一批茶样加工过程中五个加工工序的典型茶叶样品(包括鲜叶、萎凋叶、揉捻叶、发酵叶、干燥叶),作为本论文代谢组学研究的供试样品。采用液-质联用技术(UPLC-QTOF/MS)进行样品分析,应用IDEOM软件进行峰提取、峰对齐、峰注释处理,并应用MetaboAnalyst软件对原始数据进行归一化处理。采用SIMCA-P 12.0软件对归一化数据矩阵进行模型建立,分析方法包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法分析(PLS)、变量重要性投影分析(VIP)、正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)、S-plot分析等,设置合适的阈值参数,筛选并确定相关的生物标记物(biomarker)。根据生物标记物的质荷比(m/z)高精度信息,采用MassHunter软件,推测代谢物相应的可能分子式;通过对大量代谢组数据库(如HMDB、KNApSAcK、Metlin、KEGG等)的检索,对生物标记物进行定性分析。将定性后的生物标记物进行代谢途径注释,推测与红茶加工密切相关的代谢酶类,并对其在红茶加工过程中的活性变化进行分析。本课题研究对于阐明红茶加工过程中品质特征性成分的变化规律,探讨红茶品质成分的形成机理以及改进红茶传统加工工艺,都具有重要的理论研究意义和实际应用价值。本论文试验取得了以下主要结果:1.通过对红茶不同加工工序样品的主成分分析,结果显示,各加工工序茶样(鲜叶、萎凋叶、揉捻叶、发酵叶和干燥叶)能得到很好的区分,同一加工工序的茶叶供试样品聚合在一起,且与其他加工工序样品明显分开,表明红茶不同加工工序样品在内含成分组成上具有显著差别。同时,PCA结果显示,五个不同加工工序茶样按照鲜叶、萎凋叶、揉捻叶、发酵叶和干燥叶的顺序依次排列,表明各加工工序茶样中的代谢物成分是渐进发生变化的。2.通过对相邻加工工艺茶样的OPLS-DA分析,即鲜叶与萎凋叶(A组)、萎凋叶与揉捻叶(B组)、揉捻叶与发酵叶(C组)、发酵叶与干燥叶(D组)的两两对比分析,并结合VIP和S-Plot分析,筛选得到四组对比分析中的所有生物标记物,其中,A组9个,B组11个,C组6个,D组14个,共计40个biomarker;对其中相同的组分进行合并,共得到30个biomarker。这些组分即为不同加工工序间的重要差异代谢物。3.通过对上述30个生物标记物的定性分析,结果表明,这些代谢物组分主要分属于氨基酸类、生物碱类、茶多酚类、有机酸类和色素类。这些生物标记物可注释到甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径,苯丙氨酸代谢途径,黄酮生物合成途径,卟啉和叶绿素代谢途径,苯丙烷生物合成途径;表明这几条代谢途径主要参与了红茶加工过程,并导致了红茶重要品质成分的代谢变化。4.根据生物标记物的代谢途径注释结果,推测得到与红茶加工密切相关的代谢酶类,并对其在红茶加工过程中的活性变化进行了测定。结果表明,β-葡萄糖苷酶活性在鲜叶中处于较低水平,在萎凋叶中活性达到最高,约为鲜叶中活性的2倍,随后在揉捻和发酵过程中活性逐渐降低。多酚氧化酶活性在鲜叶中处于较高水平,在萎凋叶中略有下降,揉捻叶和发酵叶中逐渐下降。过氧化物酶的活性变化为萎凋叶>鲜叶>揉捻叶>发酵叶。脂肪氧合酶活性在鲜叶中较低,在萎凋叶中达到最大值,在揉捻叶中逐渐下降,发酵叶中迅速下降。醇脱氢酶在萎凋叶中活性最高,且远高于其他工序茶样,萎凋到揉捻过程中酶活迅速下降,到发酵叶中稳步降低。