干扰素是在特定的诱导剂作用下,由宿主细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,具有激活细胞的抗病毒机制,阻止病毒的复制,以及参与全身的免疫调节等功能。α干扰素属于I型干扰素,主要参与体内的抗病毒过程,虽然a干扰素并不直接作用于病毒粒子,但是能很快的激发宿主细胞产生抗病毒蛋白。近年来关于禽类α干扰素抗禽病病毒的研究很多,利用基因工程手段研发的重组鸡α干扰素有的也已经开发上市。新城疫病毒是危害养鸡业的重要疫病,具有传播广,致病率高等特点。暴发以后可采取紧急接种的方法,但是紧急接种需要一段时间才能产生免疫力,紧急接种后一段时间内仍然会有鸡死亡,因此开发治疗性的药物对新城疫的防治仍然有重要的意义。1.鸡a干扰素基因的克隆和序列分析从藏鸡肝组织中提取DNA,作为模板,通过PCR扩增鸡α干扰素基因的开放阅读框(ORF),将扩增序列与PMD-19T载体连接,转入大肠杆菌DH5a感受态细胞,培养12h,挑选疑似阳性菌落,提取质粒,PCR和酶切鉴定后送上海生工测序。测序结果显示该基因开放阅读框(ORF)长582bp,将该基因与GenBank上的其它品种鸡的α干扰素基因进行比较,同源性为99%。2.鸡α干扰素基因成熟蛋白的原核表达将扩增出的连接有藏鸡α干扰素基因全序列的PMD19-T载体为模板,设计另一对引物(上游引入酶切位点EcoRⅠ和下游引入酶切位点HindⅢ,)扩增其成熟蛋白基因,全长486bp,克隆测序；将目的基因与酶切后的表达载体PET32a(经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切)连接,转入到感受态细胞BL21当中,加入诱导剂IPTG诱导目的基因表达。利用SDS-PAGE观察表达蛋白的情况。通过单独控制温度、诱导剂浓度、诱导时间的变化比较表达结果,筛选最适的表达条件。通过测序结果可知,克隆的成熟蛋白基因未发生突变；表达的目的蛋白以不溶性的包涵体蛋白形式存在,经SDS-PAGE鉴定,诱导出的融合蛋白大小在32KD左右,与预期大小一致；诱导的最佳IPTG浓度为0.6mM,最适时间为4h,最适温度为37℃,通过在相同条件下比较BL21和Rosetta的表达量可知, BL21比Rosetta更适合作为本试验中目的基因的表达菌。采用筛选的最适表达条件进行目的蛋白的表达,然后通过包涵体的洗涤和蛋白复性,获得了较纯的蛋白,用蛋白检测仪定量,结果复性蛋白浓度达1.56mg/mL3.重组干扰素的抗新城疫病毒效果3.1重组蛋白在CEF上的抗NDV效果。将复性蛋白做10倍比稀释(10-1-10-9),分别加入到含单层CEF(鸡胚成纤维细胞)的96孔板中培养过夜(12小时),每个浓度重复8个孔(即一列),使细胞建立抗病毒状态,每孔加入100TCIDso的NDV病毒液,每8小时左右记录观察细胞的生长状况。利用Reed-muech法计算出干扰素的活性。结果证明重组干扰素能够在CEF上抑制ND病毒的毒力,并在NDV-CEF系统上测出其活性为3.16×105IU/mL。3.2重组蛋白在非免疫鸡胚上的抗NDV效果将重组鸡α干扰素(30ug)加入被100EID50NDV感染的10日龄鸡胚中,干扰素的加入分两个时间点,一个与病毒液同时加入,二个在病毒液接入24h后再接入干扰素。发现鸡胚的平均死亡时间分别被延长17和6小时,说明重组鸡干扰素在鸡胚内能抑制NDV的增值,但不能彻底抑制。3.3重组蛋白在鸡体内的抗NDV效果取30只3日龄的非免疫鸡,分6个组。第1、2、3、4组为试验组,一侧胸部肌肉均注射100EID50F48E9病毒,另一侧胸部肌肉分别注射10ug、20ug、40ug、80ug重组蛋白,第5组为空白对照组(仅注射生理盐水),第6组为病毒对照组(注射100EID50病毒液)。观察7天。阳性对照组(6组)鸡只在24h内就已出现精神沉郁,食欲减退,卧地不起等临床症状,24h后出现死亡；第1、2、3组鸡只在24h后出现相应症状,48h后出现死亡；第4组鸡只从38h后有相应症状出现,72h后开始死亡。随着重组干扰素剂量的加大,雏鸡死亡平均时间在推迟,证明该重组干扰素在雏鸡体内也抑制病毒的复制。但攻毒后7天内雏鸡全部死亡,说明重组干扰素不能完全抑制NDV强毒对鸡体的感染和致病。