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猪诱导多能干细胞的建系已有报道，但所得细胞的质量不高，外源基因多不沉默，不同细胞系之间差异较大，特征难以统一。同时，对于猪诱导多能干（iPS）细胞重编程过程的分子机理还不清楚。此外，猪胚胎干细胞的研究进展缓慢，没有建系的猪胚胎干细胞及合适的培养系统。本研究以猪成纤维细胞为受体细胞，通过逆转录病毒载体和鼠源Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc四个转录因子，将猪成纤维细胞诱导重编程为iPS细胞，并测检了重编程过程中主要基因的表达变化，揭示了猪iPS诱导过程的主要分子动力学机制。此外，还研究了Rho激酶的抑制剂Y-27632对猪iPS细胞的形态发生和生长的影响。具体结果如下：1.猪诱导多能干细胞的建系原代分离猪胎儿成纤维细胞和仔猪耳部成纤维细胞，采用逆转录病毒体系，将鼠源Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc四因子导入猪成纤维细胞，通过特定的培养条件将其诱导成为iPS细胞，并对重编程的细胞进行分子和细胞生物学的鉴定。获得的猪iPS细胞具有正常的核型，多能基因Oct4的去甲基化状态明显；实时定量RT-PCR，免疫荧光染色和基因芯片的检测结果显示，猪iPS细胞高水平表达内源多能因子和胚胎干细胞特异性的表面抗原，其基因表达图谱与诱导前的成纤维细胞显著不同；多能性检测结果显示，猪iPS细胞在体外具有向三个胚层细胞分化的能力，并且能够在猪早期胚胎中实现嵌合。上述结果表明，猪iPS细胞具有多能干细胞的典型特征，能够在体外长期稳定传代培养，并具有向三个胚层细胞发育的多向分化潜能。2.猪体细胞重编程过程的分子动力学测定对猪成纤维细胞诱导重编程过程中不同天数的细胞进行实时定量RT-PCR测检，显示内源多能基因OCT4，NANOG和TERT的表达水平在诱导后7天开始逐渐上调，诱导过程中母源印记基因GTL2显著下调，父源印记基因DLK1和DIO3则下调不明显，而与凋亡相关的BAX基因在诱导过程中有上升的趋势。碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色显示，碱性磷酸酶活性和SSEA4在诱导后6天前后开始表达，之后不断增强，阳性比率也逐渐提高。同时，通过外源报告基因GFP的显示，诱导过程中外源基因在导入后3天内表达量逐渐增加，并于诱导10天后在少量的细胞中开始逐渐下调，并最终沉默。此外，对Oct4，Sox2和Klf4三因子诱导的猪体细胞重编程过程的进行检测，显示在相同时间里，各多能性基因没有出现明显的上调，而DLK1,和GTL2下调明显，其中凋亡相关基因与四因子诱导过程相比有显著的降低。以上结果揭示了猪成纤维细胞重编程为iPS细胞过程中的分子动力学机制，显示了猪细胞重编程的特点和重要基因的表达变化，其中c-Myc对猪体细胞的重编程作用明显，为相关研究提供了重要的信息。3. Y-27632对猪iPS细胞冻存和传代效率的影响将ROCK信号通路特异性抑制剂Y-27632应用于猪iPS细胞中，发现添加Y-27632能够提高猪iPS细胞冻存后的存活率，并且可以促进细胞的贴壁和克隆形成，对猪iPS细胞的多能性不产生影响。此外，Y-27632还有助于抑制猪iPS细胞在应激条件下的凋亡，促进细胞在猪早期孤雌囊胚中的嵌合。因此，Y-27632可以作为辅助分子用于提高猪iPS细胞冻存和传代效率，抑制凋亡，促进克隆形成。