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随着人们生活水平的提高,癌症的发病率和死亡率也逐年升高,其发病率已超过心脏病,成为全球造成死亡率最多的疾病,严重威胁了人类的生命健康。其中乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤。传统最常见的癌症治疗方法化学疗法、放射疗法和手术疗法均展现出一定的弊端。光动力治疗（PDT）作为一种无侵入性、具有独特的选择性的治疗方法受到广泛关注。氧、光敏剂（PS）以及特定的光源是引发光动力效应的三要素。尽管PDT疗法具有诸多优点,但也受到了上述三要素的诸多限制。一方面,PDT是一种依赖氧气的治疗方法。然而,由于增强的肿瘤增殖活动和异常结构的肿瘤血管,肿瘤组织通常产生一定的缺氧微环境。这对于用于癌症治疗的PDT来说是极其不利的。另外,细胞癌变过程中还会产生大量的H2O2。近年来一些旨在将氧气输送到肿瘤部位的各种微载体应用已经被开发以克服缺氧环境,比如使用全氟化碳、血红蛋白（Hb）和过氧化氢酶（CAT）等作为氧的供体,显示出提高的PDT效果。另一方面,临床批准的PS只是在700 nm以下的可见光区域有效吸收光能,而这种光源仅能对皮肤表面附近发生的病变进行表浅治疗。一个改进的方法是将双光子技术应用于PDT。双光子激发光源具有更深的穿透深度,将双光子技术应用于光动力治疗有望从表浅治疗扩展到更深层的组织治疗。另外,包括本课题组在内的一些工作报道,将荧光共振能量转移（FRET）技术应用于双光子激发的光动力治疗（TPE-PDT）,在双光子光源激发下,起到TPE-PDT联动效应,能在双光子的基础上进一步增加治疗深度。但这种粒子内的FRET需要小心的设计。这是近几年来刚刚兴起的研究领域,目前国际上仅有少数课题组对此研究并获得初步进展。综上分析,如果将氧载体、光敏剂以及双光子染料共同组装在一个体系里,既可以为PDT提供丰富的O2,提高治疗效率,又能利用双光子染料双光子吸收的特点提高PDT治疗的深度。丰富的纳米药物载体和所在课题组一直致力研究的各种共组装技术将为该方案提供可能。球霰石结构CaCO3纳米粒子表现出良好的生物兼容性和生物可降解性,磷脂复合物具有很好的生物相容性并能够进行肿瘤靶向修饰,为粒子成功组装提供可能。乳腺癌严重影响女性健康,且人乳腺癌MCF-7细胞表面有表达的丰富叶酸受体,适用于药物的靶向研究,我们选取MCF-7细胞作为研究对象,对组装粒子的治疗效果进行评估。本课题研究工作主要分为以下四个部分:第一部分基于CAT的自供氧体系的合成与表征在课题组新近的工作中合成的球霰石结构CaCO3纳米粒子具有良好的生物兼容性和生物可降解性,纳米孔隙丰富,且制备条件极其温和,不引入任何有机试剂。将荧光染料FITC、光敏剂RB以及氧载体CAT以共沉积的方式组装于球霰石结构CaCO3纳米粒子中。这样一种共掺杂的载药体系进入肿瘤组织时,一方面可以清除细胞癌变过程中产生的大量H2O2,以减缓癌变过程,另一方面清除H2O2过程中产生大量O2,可以提高PDT发生效率。在被单/双光子激发时,双光子染料和RB之间发生FRET效应,探测深度增加,使PDT从表浅治疗拓展到深层组织成为可能。TEM、SEM及DLS实验结果显示合成的复合纳米粒子（F/R-CAT-VN）形貌规整、分散均一。红外分析显示FITC、RB与CAT成功键合,并经验证在单/双光子激发下均可发生粒子内FRET效应。粒子中CAT具有良好的生物活性。合成的纳米粒子在FRET作用下活性氧产生性能明显提高,有利于进一步的研究。第二部分基于CAT的自供氧体系的生物学效应研究为进一步地研究合成复合纳米粒子的抗肿瘤效应,其生物学相关效应被检测。细胞内吞实验显示基于CAT的球霰石结构CaCO3纳米粒子粒径合适,生物相容性好,易于内吞进入细胞。纳米粒子与红细胞共孵育后,并未出现明显的溶血现象,血液相容性好,适用于体内研究。F/R-CAT-VN纳米粒子在细胞内展现良好的活性氧产生性能,粒子在FRET作用下产生的活性氧数量明显多于光敏剂。细胞毒性实验显示粒子在单/双光子照射条件下都能有效杀伤细胞,暗毒性小,F/R-CAT-VN基于FRET作用对MCF-7的细胞毒性高于同等浓度的光敏剂,负载CAT的F/R-CAT-VN比不负载CAT的D-F/R-CAT-VN展现出更好的细胞毒作用。纳米粒子在小鼠体内展现良好的血管阻断效应。在体内的分布主要集中于肝脏和肿瘤。第三部分基于Hb的自供氧体系的合成与表征Hb由于其良好的载氧性能而被广泛地应用于人工氧载体的合成,磷脂因其良好的生物相容性广泛应用于抗肿瘤药物的包载。本部分实验引进具有大吸收截面的荧光染料BP,与Hb、光敏剂、叶酸磷脂共混,利用一步超声法合成磷脂靶向纳米粒子（BP@RB-Hb）。TEM、DLS结果显示合成的粒子分散性好、粒径均匀,载氧实验显示粒子呈现Hb良好的载氧功能。FRET验证实验证明粒子内FRET的有效性,并在此作用下将在模拟组织液中的探测深度扩展到2000mm。粒子的活性氧产生性能良好,在溶液中的活性氧产率高于单纯的光敏剂和不负载Hb氧载体的纳米粒子。第四部分基于Hb的自供氧体系的生物学效应研究将合成的Hb基纳米粒子进一步展开生物学效应相关研究。实验结果证明纳米粒子粒径适合,易于被细胞内吞。粒子在细胞内的活性氧产生性能好,明显大于未包载Hb的粒子和单纯的光敏剂。纳米粒子在粒子内FRET作用下,单/双光子照射时,均展现良好的抗肿瘤细胞效果,BP@RB-Hb粒子的抗肿瘤细胞活性明显高于单纯的光敏剂。纳米粒子与红细胞共孵育,展现良好的血液相容性。体内分布实验显示纳米粒子在小鼠体内主要集中分布于肝脏和肿瘤,由于叶酸的加入,纳米粒子展现良好的肿瘤靶向性。小鼠体内双光子抗肿瘤实验结果显示纳米粒子在体内具有良好的抗肿瘤效果,其抗肿瘤活性明显高于不包载Hb氧供体的粒子。综上,本研究通过简单的共组装方法,将载氧物质、双光子荧光染料和光敏剂组装于一个体系,用来解决光动力治疗抗肿瘤的治疗深度和治疗效率的问题,以乳腺癌MCF-7细胞为对象,评价治疗效果。体系中的荧光染料可以被双光子激发,在粒子内FRET的作用下,提高治疗深度;组装的氧供体可以克服肿瘤缺氧环境,提高PDT的抗肿瘤效率。体内和体外的实验都证实,粒子内可以发生有效的FRET效应,纳米粒子具有较好的稳定性、生物相容性、较深的透射深度和较强的运载氧气的能力。多功能的纳米复合物展现良好的治疗效果,对于单/双光子抗肿瘤光动力治疗的临床应用具有重要意义。