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灰树花[Grlfola frondosa(Dick，ex Fr.)S F.Groy]是一种大型担子菌，其多糖和糖蛋白（肽）复合物具有抗癌、抑制HIV逆转录酶活性、降血压和控制血糖等活性。本论文基于前期研究工作，首次以灰树花深层发酵菌丝体为原料，提取分离纯化出一种新型抗肿瘤活性糖蛋白，并对其结构特征、3D分子结构及其抗肿瘤作用机制进行研究。 主要研究结果如下: (1)以灰树花深层发酵菌丝体为原料，通过冷水浸提、硫酸铵盐析等方法获得菌丝体粗提物，利用DEAE-Sepharose Fast Flow和SuperdexTM75预装柱在AKTA purifier100快速分离纯化系统上对粗提物展开分离纯化，并以小鼠肉瘤细胞(S-180)和人胃癌细胞(SGC-7901)为靶细胞进行体外抗肿瘤活性检测，确定抑瘤活性最高的组分为GFG-3a。GFG-3a冻干样品为淡黄色絮状物，易溶于水。经SDS-PAGE测定，GFG-3a为单一组分，分子量为88.01kDa。苯酚-硫酸法测定GFG-3a中多糖含量为6.20％。气相色谱分析GFG-3a的单糖组成为阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖=1.33∶4.51∶2.46∶1。考马斯亮蓝法测定GFG-3a中蛋白质含量为87.04％。氨基酸组成分析表明，GFG-3a含有17种氨基酸，其中天冬氨酸和蛋氨酸含量较高，分别为8.52％和8.07％。综合以上分析，初步认为GFG-3a是一种微观非均一糖蛋白。热稳定性实验结果表明，GFG-3a具有一定的热不稳定性;当处理温度超过56℃后，随着处理时间的延长，GFG-3a逐渐失去其体外抗肿瘤活性，这也提示，GFG-3a中具有抗肿瘤作用的结构片段为蛋白链。 (2)采用紫外光谱(UV)、红外光谱(FT-IR)、核磁共振(NMR)、圆二色谱(CD)和生物质谱(MALDI-TOF-MS)等手段对GFG-3a的结构信息和3D分子模型进行了初步分析。综合紫外光谱、β-消除反应和红外色谱分析可知，GFG-3a含有O-糖肽键和α-糖苷键。核磁共振的13C谱和1H谱表明，GFG-3a含有-CO-NH-基团，而且其糖链结构可能存在(1-→3)-Glu、3-O-methyl-Galactose、(1→3)-β-Galacose等基团。圆二色谱分析GFG-3a的蛋白二级结构组成为16.6％的α-螺旋、44.4％的β-折叠、7.9％的β-转角和31.1％的不规则结构，提示GFG-3a是一种β-折叠占主导地位的糖蛋白。胶上酶解结合MALDI-TOF-MS分析发现，GFG-3a的氨基酸序列与NCBI库中检索到的GCN5-N-acetyltransferase的氨基酸序列有22％的覆盖率，结合在线的SWISS-MODEL Workplace软件，初步构建了GFG-3a蛋白链可能的3D分子模型。 (3)研究了GFG-3a体外抑制胃癌细胞SGC-7901增殖作用。倒置显微镜下观察发现，随着样品浓度（0-200μg/mL）和处理时间(0、24和48 h)的增加，不规则多角形细胞逐渐减少，圆形细胞逐渐增多。扫描电镜观察发现，随着GFG-3a浓度的增加，SGC-7901细胞形态逐渐不规则，表面微绒毛逐渐消失，出现小泡和凋亡小体。Hoechst染色发现，高浓度的GFG-3a（100μg/mL和200μg/mL）会导致细胞核高度凝聚，且新月状出现，许多细胞裂解为碎片，或细胞膜表面出现突起。彗星电泳研究表明，随着GFG-3a浓度的增大（0-200μg/mL），胃癌细胞SGC-7901的DNA损伤程度逐渐增加。Annexin V-FITC/PI双染结果表明，GFG-3a浓度从0μμg/mL增大到200μg/mL时，晚期凋亡细胞的比例从1.4％增大到63.4％。PI染色流式细胞术检测结果再次证实，GFG-3a可阻滞SGC-7901细胞在G2/M期，进而影响细胞的分裂和增殖。采用荧光定量PCR和DNA-PAGE电泳检测了凋亡相关基因的表达，结果表明，GFG-3a通过上调细胞凋亡信号通路中p53、Casp8、Casp3、Bax、Bad，下调Bcl2、Bcl-xl、PI3K和AkT1的表达诱导细胞凋亡，最终实现其体外抗肿瘤的作用。进一步的蛋白组学分析表明，SGC-7901细胞在GFG-3a处理前后共有21显著的差异点，其中11个蛋白下调，10个蛋白上调，其中RBBP4、RUVBL1、NPM、HNRNPH2、HSP90AB1、GRP78、ACTL6A和ARCN1分别是与细胞周期、调亡和内质网压力响应直接相关的蛋白质。最后Western blot再次证明了GFG-3a可以上调p53、Casp8、Casp3、 Bad和RBBP4的表达，下调Bcl2、NPM、GRP78和HSP90B的表达。