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叶片黄化是植物衰老的重要标志之一。逆境会加速植物叶片中叶绿素和蛋白质降解,进而导致叶片早衰。逆境诱导的叶片早衰不仅降低了草坪质量,也影响了饲草品质。因此在草坪草和牧草两用型多年生黑麦草(Lolium perenne L.)叶片中阻断或抑制叶绿素的降解,理论上可以获得滞绿型和高饲草品质的转基因种质资源。深入研究多年生黑麦草叶绿素降解通路及其调控机制,可以为多年生黑麦草转基因育种提供理论基础。本研究以多年生黑麦草为材料,克隆得到了叶绿素降解的核心调控基因STAY-GREEN(LpSGR),并对其功能和调控叶绿素降解机理进行了系统分析。根据已知的拟南芥和水稻滞绿基因信息,采用RACE-PCR技术在多年生黑麦草中克隆得到了滞绿基因LpSGR(NCBI基因数据库登录号为AQM55942)。LpSGR基因编码区由864个碱基组成,其编码了 287个氨基酸,且具有典型的SGR功能域。LpSGR基因组序列与单子叶植物(例如水稻、二穗短柄草、高粱和玉米)的SSGR基因组结构相同,都包括2个内含子和3个外显子,而杨树、大豆、拟南芥和蒺藜芷蓿等双子叶植物的SGR基因组结构却含有3个内含子和4个外显子。同源比对结果显示LpSGR基因的核酸序列与BdSGR、OsSGR、ZmSGR、SbSGR和AtSGR的相似度分别为 82%、81%、80%、78%和 67%。过量表达LpSGR促进了野生烟草(Nicotiana benthamiana)及拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶绿素降解;LpSGR和AtSGR回补了拟南芥sgr突变体叶片及果夹的滞绿表型;LpSGR定位于叶绿体,并能与其他叶绿素降解蛋白(LpNOL、LpNYC1和LpPPH)在叶绿体中互作,说明与AtSGR功能相同,LpSGR基因编码脱镁螯合酶(Magnesium-Dechelatase)在叶绿体中不仅可以催化叶绿素a为脱镁叶绿素a的反应,还可以通过与其他叶绿素降解蛋白的互作来调控叶绿素降解。LpSGR的转录水平随着衰老的进程而增加,比如衰老后期叶片中的LpSGR基因的表达量极显著高于成熟叶片。脱落酸和乙烯通过其信号传导转录因子(LpABF3、LpABI5、ORE1和EIN3)直接识别并激活LpSGR启动子,进而促进LpSGR基因的表达。而细胞分裂素则可能通过其信号传递转录因子LpARR1、LpARR10和LpARR12与脱落酸信号途径转录因子LpABF3和LpAB15的互作,间接地抑制LpSGR基因的表达。褪黑素直接或间接地抑制了LpSGR基因的表达,从而延缓了在黑暗和高温诱导条件下多年生黑麦草的叶片黄化。通过RNA干扰LpSGR抑制了多年生黑麦草叶绿素的降解通路。在黑暗离体处理8天后,转基因多年生黑麦草叶片中叶绿素含量显著高于野生型。由于LpSGR可以和光捕捉系统蛋白形成聚合体,因此RNA干扰LpSGR可以延缓光捕捉系统蛋白的降解。与野生型多年生黑麦草相比,转基因株系叶片中的粗蛋白含量、体外干物质可消化率和粗脂肪含量显著升高,而转基因株系叶片中的酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、游离镁离子含量和粗灰分含量显著降低。这些结果说明LpSGR不仅参与调控叶绿素降解,还影响了多年生黑麦草饲草品质变化。RNAi:LpSGR转基因多年生黑麦草与野生型转录数据分析结果表明,RNA干扰LpSGR改变了植物激素信号传导途径,进而延缓了叶片衰老进程;野生型多年生黑麦草衰老叶片中和衰老相关的脱落酸、乙烯和茉莉酸信号传导通路基因表达与成熟叶片相比显著上调;细胞分裂素响应转录因子B-ARRs和A-ARRs转录因子也显著上调;在RNAi:LpSGR转基因株系衰老叶片中脱落酸、乙烯以及茉莉酸等衰老促进激素响应转录因子的基因表达与成熟叶片相比显著下调,这与转基因株系具有缓慢的衰老速度相吻合。RNA干扰LpSGR改变了多年生黑麦草衰老过程中光合代谢、蛋白合成代谢、脂质代谢、以及饱和、非饱和脂肪酸合成代谢等通路基因的表达。这些代谢通路的改变可能导致了 RNAi:LpSGR转基因株系具有高饲草品质等优点。本研究为滞绿基因LpSGR在多年生黑麦草分子育种上的应用奠定了良好基础。