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目的通过体外细胞实验,采用TGF-β1体外刺激肺泡II型上皮细胞制备上皮间质转化(EMT)的细胞模型。本实验主要研究了骨髓间充质干细胞条件培养基(BMSCs-CM)对TGF-β1诱导的肺泡II型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化(EMT)的调控作用,并探讨了BMSCs-CM是否通过调控Smad3信号通路的活性而抑制EMT过程,进而发挥其抗纤维化的作用。方法1模型制备及分组:3~5周龄的SPF级雄性SD大鼠,体重约100~120g,常规无菌条件下分离、培养BMSCs,通过细胞贴壁法对其进行纯化,传代并收集第3~5代细胞的条件培养基,浓缩处理并冻存备用。体外培养肺泡II型上皮细胞A549细胞,并随机分为四组:对照组,TGF-β1刺激组(TGF-β1组),SIS3抑制剂组(SIS3组),BMSCs-CM干预组(BMSCs-CM组)。2指标检测及方法:(1)一般形态学检测:倒置相差显微镜观察BMSCs的形态及A549细胞的形态学改变;(2)鉴定BMSCs:采用流式细胞仪检测BMSCs细胞表面标记物CD29,CD45,CD54和CD109的表达;(3)透射电镜观察肺泡II型上皮细胞内嗜锇性板层小体的变化;(4)免疫细胞荧光法检测E-cad,α-SMA和p-Smad3的表达及分布;(5)免疫印迹法检测E-cad,α-SMA,p-Smad3,Snail1和I、III型胶原的蛋白表达量。3统计学分析:用Image J医学图像分析系统对蛋白特异表达条带进行半定量分析,得出光密度值(OD值),然后以目标蛋白的OD值比内参(β-actin)OD值的比值作为分析对象进行比较。实验中所得数据用Excel建库,均用均值±标准差((?)±s)表示,用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析,两组间比较用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果1原代BMSCs细胞胞体较小,形态多为梭形或圆形,核居中。传代后细胞增长加速,呈现漩涡状或平行排列状集落生长,随着传代次数的增加,细胞形态更为均一。2 A549细胞的形态学观察结果:对照组中细胞呈类圆形或铺路石状,细胞间连接紧密。与对照组比较,TGF-b1后细胞呈长梭形或纺锤形,细胞间连接松散,体积增大,间隙增大,随时间延长变化愈加明显。BMSCs-CM组和SIS3组细胞形态基本一致,细胞向长梭形变化的趋势不明显。3 BMSCs细胞表面标记物表达的鉴定结果:CD29,CD106抗体阳性表达率分别为76.11%,74.56%,为阳性表达,CD45,CD54抗体阳性表达率分别为3.88%,5.05%,为阴性表达。4透射电镜观察结果:A549细胞内有呈平行排列或同心圆排列,外有薄膜的肺泡II型上皮细胞特有的嗜锇性板层小体。与对照组相比,TGF-β1作用48 h后,嗜锇性板层小体变性、肿胀、空泡变并随TGF-β1作用时间的延长彻底消失。而BMSCs-CM干预组和SIS3组内细胞胞浆中嗜锇性板层小体变性程度比TGF-β1组有所减轻。5免疫细胞荧光法检测结果:上皮标志物E-cad为绿色荧光表达,分布在胞浆中;间质细胞标志物a-SMA为红色荧光表达,构成细胞的骨架结构;p-Smad3为红色荧光表达,在胞浆和胞核中均有表达。对照组细胞内E-cad强荧光表达;而a-SMA仅少量表达,几乎无荧光可见;p-Smad3荧光表达很弱,仅有少量基础表达。给予TGF-b1诱导作用后,随着细胞形态的改变,胞浆内上皮标志物E-cad的表达减少,荧光减弱;而间质标志物a-SMA荧光表达增强;p-Smad3荧光表达强度增强,且细胞核内比胞浆更为明显。给予BMSCs-CM干预后,细胞内E-cad荧光的表达有所增强,胞体内肌丝样结构减少,p-Smad3荧光表达强度减弱。6免疫细胞印迹检测结果:对照组上皮标志物E-cad蛋白表达明显,间质标志物a-SMA和通路蛋白p-Smad3,Snail1仅有少量基础表达。同对照组比较,经TGF-b1刺激后,随着细胞形态逐渐变成长梭形,E-cad蛋白表达明显减弱(P﹤0.05),a-SMA,p-Smad3,Snail1,I型胶原,III型胶原表达明显增强(P﹤0.05)。BMSCs-CM组和SIS3组,E-cad表达较TGF-b1刺激组相比明显增加(P﹤0.05),但仍低于对照组;而a-SMA,p-Smad3,Snail1,I型胶原,III型胶原得表达明显减少(P﹤0.05),但仍高于对照组的基础表达。结论1肺泡II型上皮细胞在TGF-b1诱导下可以发生EMT,同时促进了I、III胶原蛋白的表达;2 Smad3信号通路参与调控TGF-b1诱导的EMT过程;3 BMSCsCM可能是通过调控TGF-b1/Smad3信号通路,从而达到抑制肺泡II型上皮细胞发生EMT的效果。