前言　　脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的起源于神经上皮组织的原发恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的46％。统计资料表明脑胶质瘤的发病率为3～10/10万，占全身恶性肿瘤的1％～3％，手术加放化疗的平均生存期仅为8～11个月。胶质瘤对化疗药物耐药导致了化疗对胶质瘤治疗效果不理想，是胶质瘤术后平均生存期较低的主要原因之一。因此，研究胶质瘤对化疗药物的耐药机制，对于开发新的化疗药物，寻找胶质瘤新的治疗靶点都具有十分重要的意义。　　整合素连接激酶(integrinlinkedkinase，ILK)是Hannigan等人在1996年人类cDNA文库双酵母杂交筛选实验中，应用β1整合素胞浆结构域发现的，它是一种含有3个结构域的Ser/Thr蛋白激酶，ILK的cDNA全长为1.8kb，由452个氨基酸残基组成。编码人类ILK的基因定位于人染色体11p15.5-p15.4，基因全长为8.8kb，包括13个外显子和12个内含子。ILK活性较低，在细胞与ECM粘附时或生长因子作用下，通过PI3K依赖激活机制被激活，可能的调控机制为PI3K的产物3，4，5-三磷酸肌醇PIP3通过磷酸肌醇结合序列和ILK的PH序列直接结合而发挥作用。ILK可以被PTEN和ILKAP两个磷酸酶负性调控。在ILK过表达的细胞中分析ILK活性，发现它能激活多种信号传导途径。上皮细胞ILK过表达可导致PKB/Akt和GSK-3磷酸化表达增加。近年来幼大量的研究表明ILK可通过诱导上皮间质转化(EMT)而促进肿瘤细胞恶性表型出现，多种类型肿瘤EMT中通过NF-κB通路起着重要的调控作用。Duxbury等人的研究还表明通过RNAi抑制ILK的表达可降低胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗耐药性，提示ILK可能与肿瘤的多药耐药有关。然而，ILK是否也与脑胶质瘤的耐药有关仍然不清楚。本实验通过过表达ILK研究其对胶质瘤耐药性的影响;通过转染ILK基因观察其是否可以引起重组转染组肿瘤细胞的侵袭及转移能力增加及其机制;应用NF-κB阻断剂阻断该通路，探讨ILK是否通过NF-κB通路调控胶质瘤细胞的EMT。　　材料和方法　　一、过表达ILK促进脑胶质瘤细胞对替莫唑胺耐药　　扩增人ILK全长编码序列，将目的基因和真核表达载体pEWP-C1质粒（含Neo抗性基因）行定向连接，将其产物转化细菌感受态细胞，应用PCR方法鉴定阳性克隆，并行测序和分析对比，可获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-C1-ILK。然后通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-C1-ILK转染到体外培养的SHG-44细胞，经G418筛选，建立稳定表达ILK的胶质瘤细胞系。　　实验细胞分三组:对照组、空载组及稳定转染组。　　应用Westernblot和RTPCR法进行转染鉴定。应用MTT法检测各组细胞的增殖，应用Hoechst法及流式细胞术检测各组细胞的凋亡，并检测抗凋亡蛋白、凋亡蛋白的表达情况及Caspase的活性。　　二、过表达ILK促进脑胶质瘤细胞的侵袭转移　　实验细胞分三组:对照组、空载组及稳定转染组　　分别应用Elisa法及Westernblot法检测基质金属蛋白酶（MMP）9、2的表达　　应用细胞划痕实验测定细胞迁移率，应用Transwell实验检测细胞侵袭的程度。利用相差显微镜观察细胞形态。　　三、过表达ILK通过NF-κB信号通路促进脑胶质瘤细胞的上皮间质转化　　分别应用NF-κB特异性阻断剂BAY11-7028及siRNA方法阻断NF-κB信号传导通路　　实验分七组:对照组、空载组、稳定转染组、空载+BAY11-7028组、稳定转染+BAY11-7028组、空载+p65siRNA组、稳定转染+p65siRNA组　　首先应用Westernblot方法检测对照组、空载组及稳定转染组的EMT标记物snail、slug、twist、vimentin、E-cadherin蛋白表达的检测，然后阻断NF-κB信号通路后，再次检测上皮标记物E-cadherin蛋白表达。　　结果　　一、过表达ILK促进脑胶质瘤细胞对替莫唑胺耐药　　重组质粒pEGFP-C1-ILK鉴定:所得的PCR片段和预期大小1.8kbp相一致。将阳性克隆测序，测序结果应用cnkiblast分析，证实插入的目的片段与基因库检索的人ILK的cDNA序列100％匹配，证明PCR过程中无突变发生。以上结果证实重组质粒pEGFP-C1-ILK构建成功。然后应用G418筛选出稳定转染ILK的SHG-44胶质瘤细胞系。　　转染鉴定:Westernblot的结果显示:转染组的ILK蛋白表达明显高于空载组及对照组(P＜0.01)，RT-PCR显示:稳定转染组ILK明显高于对照组的表达(P＜0.01)，以上的结果证实ILK转染成功。　　Westernblot法检测各组细胞中多药耐药基因MDR、MRP蛋白质的表达结果显示:稳定转染组细胞的MDR、MRP蛋白质表达均明显增高，说明稳定转染ILK的胶质瘤细胞并未失去合成多药耐药基因蛋白的功能，因此从功能上来说，稳定转染的ILK的SHG44胶质瘤细胞保持了原肿瘤细胞的功能特性。　　MTT法检测各组细胞增殖结果显示:在24小时，48小时及72小时三个时间点（ILK+TMZ组）的OD值明显高于对照组，差异有统计学意义P＜0.01;以上结果说明过表达ILK能够促进SHG44胶质瘤细胞的增殖。　　Hoechst法检测结果:免疫荧光显微镜下，凋亡细胞呈现细胞核致密浓染或碎块状致密浓染，（稳定转染+TMZ）组凋亡细胞明显少于（空载体+TMZ）组，说明过表达ILK能减少胶质瘤细胞的凋亡，即降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。　　流式细胞术检测:（稳定转染+TMZ）组早期凋亡细胞明显少于（空载体+TMZ）组，说明过表达ILK可以减少胶质瘤细胞在TMZ作用下的凋亡，即降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。　　Westernblot检测结果:(稳定转染+TMZ)组与(空载+TMZ)组比较，可以明显提高肿瘤细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时可以明显减少凋亡相关蛋白Bax的表达。结果显示过表达ILK可以增加抗凋亡蛋白表达，同时减少凋亡相关蛋白的表达，从而减少胶质瘤细胞的凋亡，降低了肿瘤细胞对TMZ的敏感性。　　试剂盒法检测Caspase3活性检测:caspase-3的活性在(稳定转染+TMZ)组明显低于(空载体+TMZ)组，差异有统计学意义(P＜0.01)，该结果说明过表达ILK可以降低凋亡关键酶caspase-3的活性，从而减少胶质瘤细胞的凋亡，降低了肿瘤细胞对TMZ的敏感性。　　二、过表达ILK促进脑胶质瘤细胞的侵袭转移　　Elisa法检测结果和Westernblot法检测结果一致:稳定转染组的MMP-9、MMP-2表达均明显增加，与对照组及空载组比较（P＜0.01）差异有统计学意义。　　细胞划痕实验:6小时:空白对照组、空载组、稳定转染ILK组，细胞迁移率分别为:30％，33％，68％;12小时:空白对照组、空载组、稳定转染ILK组，细胞迁移率分别为:77％，76％，95％。稳定转染ILK肿瘤细胞移动速率增加(P＜0.01)，而对照组及空载组比较差异无统计学意义(P＞0.01)。实验表明过表达ILK可明显增加SHG44肿瘤细胞的迁徙能力。　　Transwell小室法:种植的各组细胞在培养24小时以后，计数膜的下表面细胞数结果:对照组和空载体组和稳定转染ILK组的细胞迁移数分别为:92、87、229。稳定转染ILK的细胞穿透膜的数目明显高于其他两组(P＜0.01)，而对照组与空载组的细胞穿透膜的数目无统计学差异(P＞0.01)，表明过表达ILK可明显增强胶质瘤细胞(SHG44)的侵袭能力。　　三、过表达ILK通过NF-κB信号通路促进脑胶质瘤细胞的上皮间质转化　　Westernblot检测EMT标记物蛋白的表达:结果显示稳定转染组中snail，slug，twist，vimentin的表达较对照组及空载组的表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01），而E-cadherin的表达则在稳定转染组中明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。　　当分别用NF-kB特异性阻断剂BAY11-7028及p65SiRNA的方法阻断该通路后，Westernblot方法检测E-cadherin蛋白表达结果显示:稳定转染组中E-cadherin蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。　　结论　　1.稳定转染ILK的SHG-44肿瘤细胞系建立及筛选成功，并且该稳定转染细胞系ILK明显过表达。　　2.过表达ILK可以通过增加抗凋亡蛋白的表达，降低凋亡相关蛋白的表达、下调caspase-3的活性、抑制肿瘤细胞的凋亡、促进其增殖，降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性，增强其耐药性。　　3.过表达ILK可促进脑胶质瘤细胞的侵袭和转移。　　4.过表达ILK通过NF-κB信号通路促进脑胶质瘤细胞的上皮间质转化。