研究背景及目的AngII是肾素—血管紧张素系统(RAS)中重要的活性肽,其在体内的作用相当广泛,不论是在循环中的单核细胞中,还是在动脉粥样斑块的巨噬细胞中都有AngII表达,免疫组化显示血管紧张素转化酶(ACEI)与AngII、血管紧张素I受体(AT1R)在人的冠状动脉粥硬化斑块中共表达。诸多实验证明RAS无论是在早期还是在晚期,无论是其短暂性升高还是持续性刺激都有促进粥样硬化的作用。AngII与粥样斑块的发生及发展上有着密切的联系。另有研究证明AngII可诱导巨噬细胞中的MMPs的分泌,这表明了AngII在调节斑块稳定中也起着重要的作用。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,炎症因子在粥样斑块形成、发展及破裂方面的详细机制一直是研究的热点。已有多项研究显示炎症细胞及因子在斑块的性质及稳定性上占有举足轻重的地位。Cipollone及其同事的近几年综述阐述粥样斑块中的环氧化酶-2/前列腺素E2(COX-2/PGE2)在ACS的发生、发展上起着非常重要的作用,作为炎症因子之一的COX-2/PGE2及其信号途径,不但参与了体内广泛的炎症反应过程,而且在早期的斑块形成及晚期的斑块破裂上也有着重要的作用,抑制COX-2及其下游的前列腺素E合成酶后可起稳定斑块的作用。Cipollone的进一步研究发现,COX-2、巨噬细胞及AngII在斑块的肩部共染且AngII可通过AT1/COX-2/mPGES-1途径促进MMPs的表达。这些说明COX-2/PGE2的表达对斑块稳定方面有着重要的影响。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinases inducer,EMMPRIN)是单次跨膜、高度糖基化的免疫球蛋白家族。其高表达于肿瘤细胞表面,可刺激人成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)而成为研究肿瘤浸润和转移机制方面的热点。近年研究发现,EMMPRIN在冠状动脉粥样硬化斑块中,尤其是在易损斑块的巨噬细胞中有着高表达,且与MMPs的表达区域基本一致。另外如肿瘤坏死因子、C-反应蛋白等炎症因子亦可引起EMMPRIN的表达增加,这说明EMMPRIN与炎症因子之间关系亦很密切。EMMPRIN是调节MMPs的产生及分泌的一个重要因子,MMPs是一类酶活性依赖钙、锌离子的蛋白酶超家族,其可分解纤维帽致使斑块不稳定而易致脑卒中急性冠脉综合症等后续事件的发生。而作为调节MMPs的一个重要因子EMMPRIN,其在易损斑块的巨噬细胞富含区也有着高表达,且EMMPRIN、MMPs与巨噬细胞共定位于粥样斑块中,体内、外实验,亦证明在EMMPRIN在细胞内的表达改变后, MMPs的表达亦会随着EMMPRIN的改变而改变。在心肌梗死发生时EMMPRIN及MMP-9都可明显增高,而当心肌梗死被成功治疗后其在血液中的表达水平又可恢复正常,从上述我们可以知道EMMPRIN在调节MMPs的表达上有着关键的调控作用。此实验以THP-1巨噬细胞为模型,拟深入探讨AngII在THP-1巨噬细胞中对EMMPRIN表达以及调节作用:1、AngII可诱导巨噬细胞中COX-2、PGE2、EMMPRIN的表达;2、COX-2、PGE2、EMMPRIN的表达上调作用是通过AT1受体,AT1受体拮抗剂可抑制该表达,而AT2受体拮抗剂则无该作用;3、证明AngII通过AT1/COX-2/PGE2促进EMMPRIN表达的信号通路存在。实验方法1、人类单核细胞株(THP-1)细胞用完全培养基(含10%的胎牛血清、100U/ml的盘尼西林、100μg/ml的链霉素)、37℃下在含95%空气、5%CO2的孵育箱中培养.将细胞数调整至1×106 cells/ml移至六孔板中,每孔接种1ml。参照文献进行最优化诱导,加5ng/ml的佛波脂于六孔培养板中,诱导培养48小时后,更换含无血清的培养基继续培养24小时。2、AngII对巨噬细胞活性影响测定:佛波醇诱导后的人类单核细胞株细胞以1×105的数量接种于96孔板上,每孔加100μl的RPMI-1640培养基,接着以不同浓度(0.01μΜto 50μΜ)的AngII对人类单核细胞株诱导后的巨噬细胞刺激24小时,然后再用加入MTT溶液刺激4小时,对照组则只加入0.1%二甲基亚砜,去除培养基溶于二甲基亚砜中,最后在波长550 nm处测其值。3、实时RT-PCR:在每孔细胞中加入1mL Trizol,按说明书进行提取,紫外分光光度计测定RNA A260/A280的比值及量。取1μg巨噬细胞的总RNA,根据RT盒的说明书操作,以Oligo-dt12进行cDNA的合成.基因COX-2、EMMPRIN、β-actin进行PCR扩增的引物序列分别是:COX-2:上游: 5’- GATTGCCCGACTCCCTTGG- 3’,下游: 5’- AAAACTGATGCGTGAAGTGCTG- 3’; EMMPRIN:上游: 5’- GAA TGA CAA AGG CAA GAA CG- 3’,下游: 5’- GAA GGA AGT GTA TGA TGG GAAT -3’;β-actin:上游: 5’- GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT- 3’,下游: 5’- GAAGTGGGGTGGCTTTTA GGA- 3’。基因表达用SYBR Green1荧光定量PCR在iQ?5 (Bio-Rid, USA)上进行监测,结果用该仪器进行分析。4、蛋白提取和Western blot:用4℃预冷的RIPA裂解液(含pH 7.5 20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mmol/L EDTA, 10μg/mL亮抑蛋白酶肽,2μg/mL胰蛋白酶抑制剂,1 mmol/L苯甲基磺酰氟)裂解细胞,收集裂解的细胞在4℃下,离心半径为7cm,12000转高速离心10 min ,蛋白浓度用Lorry法来测定。取50μg总蛋白样品,与上样缓冲液混匀后100℃煮5 min,在10%SDS-PAGE中行垂直电泳(100V,100min),室温150 mA×90 min转样品至硝酸纤维素滤膜,5.0 %脱脂奶粉在4℃下温和振荡封闭3 h。取出膜结合相应的一抗(鼠抗人EMMPRIN单克隆抗体浓度为1:1000;兔抗人COX-2多克隆抗体浓度为1:1000),振荡过夜,TBST洗膜后,结合相应的二抗(兔抗鼠红色荧光二抗浓度为1:5000;羊抗兔绿色荧光二抗为1:5000),室温30 min.用Odyssey2.0软件进行扫描及分析。5、PGE2的ELISA试剂盒购自中杉金桥生物有限公司,上清中PGE2含量按照PGE2酶联免疫测定试剂盒操作说明进行检测。在酶标监测仪上测定450 nm波长的光密度值。结果1、成功建立THP-1巨噬细胞模型:人类单核细胞株(THP-1)细胞在5ng/ml的佛波醇诱导下,倒置相差纤维镜下观察细胞从悬浮变成贴壁并且聚集成团,诱导达一定时间后开始伸出伪足,诱导48小时后经细胞计数比较,贴壁细胞/总细胞大于95%,继续培养24小时后,细胞贴壁稳固,伪足伸展充分,诱导成功。2、AngII对人类单核细胞株巨噬细胞活性的测定:不同浓度的AngII(0.01 to 50μΜ)刺激后,人类单核细胞株形成的巨噬细胞活性用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法测定。结果显示,在10μΜAngII刺激下与0μΜ组比,细胞的活性有改变,但没有统计学意义(P>0.05)。而在50μΜ的AngII刺激下,细胞活性的降低与0μΜ组比,已有显著差异(P<0.05)。故本实验选择AngII浓度在10μΜ之内,对诱导结束后的人类单核细胞株巨噬细胞不会产生毒性作用。3、AngII刺激巨噬细胞可增加COX-2和EMMPRIN基因及蛋白的表达:THP-1诱导成功后,在10-6mol/L浓度的AngII刺激下,分别用RT-PCR及Western blot检测基因及蛋白的表达。结果显示在不同的刺激时间点上(o h、6 h、12 h、24 h), COX-2基因表达及蛋白的表达的与对照组(0h组)相比,差别均有统计学意义(P< 0.05,基因及蛋白的表达都以β-actin作为内对照),在刺激12h后达到峰值,且比对照组增加约5倍。进一步分析可看出在AngII刺激下EMMPRIN的表达趋势与COX-2的变化基本一致。4、AngII刺激后上清中PGE2表达量的测定:按照PGE2酶联免疫测定试剂盒操作说明,检测在浓度为10-6mol/L的AngII的刺激下,上清中PGE2含量的变化。从实验结果中我们可以得出,在刺激12h后,THP-1巨噬细胞分泌至上清中的PGE2达到顶峰,随后下降。相比于对照组(对照组为RPMI-1640培养基组)增加近6倍。其变化趋势与COX-2的变化基本一致。5、氯沙坦可阻滞AngII引起的巨噬细胞中COX-2及EMMPRIN的上调作用:为证明AngII是通过AT1或者AT2受体诱导COX-2及EMMPRIN的上调作用。实验分四组进行阐述(细胞在AngII刺激前预先分别用氯沙坦及PD123319处理1h)。12h后检测基因及蛋白的表达。实验结果显示,COX-2及EMMPRIN的基因及蛋白的表达:AngII刺激组比RPMI1640培养组有明增加(P<0.01),AngII+氯沙坦干预组与RPMI1640培养组相比差异无统计学意义(P>0.05),AngII+ PD123319干预组与RPMI1640培养组相比有明显增加(P<0.01),AngII+ PD123319干预组与AngII刺激组相比差异无统计学意义(P>0.05)。这个结果显示AngII诱导的COX-2及EMMPRIN的表达是通过AT1受体的,其作用可被氯沙坦所阻断。6、AngII通过AT1/COX-2/PGE2途径诱导巨噬细胞中EMMPRIN表达上调:进一步实验我们设计了六个组详细说明COX-2/PGE2在信号转导中的作用。从结果中我们可以看出AngII上调的EMMPRIN不但可以被氯沙坦所阻断,也可以被NS-398所抑制,而且分别在此两组抑制组中加入PGE2后,抑制作用可被翻转,因此我们证明AngII是通过AT1/COX-2/PGE2信号通路诱导EMMPRIN的表达。结论1、AngII可诱导THP-1巨噬细胞中COX-2、PGE2及EMMPRIN的表达;2、AngII刺激的THP-1巨噬细胞中EMMPRIN表达的增加通过血管紧张素I受体,血管紧张素I受体拮抗剂可抑制该刺激作用,而血管紧张素II受体拮抗剂则无该作用。3、THP-1巨噬细胞中存在着AT1/COX-2/PGE2/EMMPRIN这一信号通路。