蒽与其受体介导的抗体相互作用及其酶联免疫检测研究

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近年来多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)由于自身稳定的化学特性而逐渐积累于环境中,各种矿物燃料或者其他高分子有机物的非完全燃烧和热解反应产物中均含有PAHs。PAHs有极强的“三致”作用,目前已经严重威胁到人体健康和生态环境,因而有必要对PAHs在环境介质中的含量及迁移转化机制进行研究和监测,目前常用的检测方法存在样品前处理复杂,分析成本高,检测周期长,仪器设备昂贵等不足之处。近年来,酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)由于其操作简便、特异性好、检测限低而被广泛用于环境样品分析。  为建立多环芳烃的快速检测方法,本文从暴露于污染物蒽的鲤肝脏中提取出芳香烃受体,采用紫外可见分光光度计进行最大吸收波长扫描,并通过离子交换层析法分离纯化了芳香烃受体,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了受体的分子量,然后通过傅里叶变换红外光谱分析探讨了芳香烃受体与污染物配体蒽结合后其蛋白结构的变化。在此基础上将配体与受体结合形成的复合物作为抗原,复合物的抗体作为一抗,以辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG作为二抗,经显色反应,利用酶标仪测定吸光度,通过绘制的标准曲线,计算待测样品中蒽的含量,同时优化该方法各环节中的实验条件,并对试剂盒的特异性、重复性、保质期及加标回收率等进行测试。具体实验结果如下:  (1)紫外扫描图谱显示肝脏粗提取物在280nm处有蛋白特征吸收峰;通过蛋白质标准曲线方程(y=0.0067x+0.0238,相关性系数R2=0.9958)计算得到受体蛋白浓度为27.3 mg/mL;利用离子交换层析法得到了单一组分的芳香烃受体蛋白;由聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量大约为110 kD。  (2)由傅里叶变换红外光谱图可知,受体与蒽结合后其蛋白二级结构发生了明显变化,特定波段范围内的谱峰较结合蒽之前发生了明显位移,其结合区域主要发生在酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅲ带及指纹区,此外谱峰大多数是向低波数方向移动。  (3)通过ic-ELISA法测得AHR抗体的效价为1:64000;ELISA分析方法的最适工作条件如下:包被抗原和一抗的最佳稀释倍数分别为2000和8000;酶标二抗的最佳稀释倍数为2000;最佳包被条件为抗原在4℃条件下包被12 h;最佳封闭液选择为1%明胶,最佳封闭条件为37℃条件下封闭1.0h;抗原与一抗的最佳温育时间为1.0h,温度为37℃;一抗与二抗的最佳结合时间为1.0h,温度为37℃;最佳显色条件为不避光显色15 min。  (4)蒽的标准曲线(y=-0.11x+1.1713,R2=0.9826)在10 ng/mL~10μg/mL范围内均有良好的线性;其半抑制浓度IC50为185.95 ng/mL;最低检测限约为2.43ng/mL。  (5)抗体与其它3种结构类似抗原的交叉反应率分别为5.7,19.1及<0.1,其交叉反应率均较小,表明抗体特异性强;OD值板内及板间的变异系数分别为4.19%~9.23%和5.82%~9.51%,均小于10%;该试剂盒的保质期为两个月。  (6)将建立的ic-ELISA方法用于实际样品的检测,结果表明湖水和河水样品中均有不同程度的蒽含量检出,而自来水中则未测出;其CV为3.85%~9.52%,均小于10%;蒽的加标回收率范围为89.15%~113.57%,方法的准确度符合分析的要求。
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