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目的:本课题在先前研究基础上,采用缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）损伤PC12细胞模型,复制缺血缺氧性脑病中缺氧/复氧病理过程,探讨该模型与铁死亡的关系,并进一步观察远志皂苷元（Senegenin,Sen）对H/R细胞模型中铁死亡的影响及可能机制,希望能为相关疾病的防治提供新的思路和实验依据。方法:实验分为两部分:第一部分:H/R细胞模型和铁死亡细胞模型对比研究及干预1.MTT法筛选最佳实验条件（时间及药物浓度）:（1）H/R最佳造模时间;（2）铁死亡诱导剂（erastin）诱导PC12细胞铁死亡的最佳浓度;（3）远志皂苷元（Senegenin,Sen）和铁死亡抑制（Ferrostatin-1,Fer-1）对PC12细胞的毒性作用;（4）Sen和Fer-1在两个模型中的最佳干预浓度。2.根据筛选的实验条件,将实验组分为:（1）对照组:Control组、Sen组、Fer-1组;（2）模型组:H/R组、铁死亡组（erastin组）;（3）Sen干预组:H/R+Sen组、erastin+Sen组;（4）铁死亡抑制剂干预组（Fer-1干预组）:H/R+Fer-1组、erastin+Sen组;MAP-2免疫荧光染色后观察各组细胞的形态变化;酶标仪检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）水平（即LDH细胞漏出率）第二部分:Sen对H/R诱导PC12细胞铁死亡的影响及机制1.实验分组同第一部分2;2.酶标仪检测细胞内铁离子水平、总谷胱甘肽（Total Glutathione,GSH）及谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）的含量变化;3.荧光显微镜观察检测荧光探针DCFH-DA标记细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平变化;4.荧光显微镜观察和流式细胞术检测荧光探针JC-1染色细胞内线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,△Ψm）变化;5.Western Blot检测铁死亡相关蛋白（ACSL4、GPX4、SLC7A11蛋白）表达情况。结果:第一部分:H/R细胞模型和铁死亡细胞模型对比研究及干预1.MTT实验结果显示:缺氧12小时,复氧2小时,细胞活力下降50%左右（P<0.05）,确定该时间为造模时间;10μmol/l铁死亡诱导剂（erastin）作用PC12细胞14小时,细胞活力下降接近50%（P0.05）;经不同浓度Sen和Fer-1交叉干预后,H/R+Sen（60μmol/l）组、H/R+Fer-1（5μmol/l）组、erastin+Sen（60μmol/l）组和erastin+Fer-1（5μmol/l）组的细胞活力与模型组相比,显著增强（P<0.05）。2.荧光显微镜观察结果显示:H/R组和erastin组细胞形态与对照组相比,细胞变小变圆,折光度降低,贴壁状态差,漂浮细胞多,突触变短或消失（P<0.05）;经Sen和Fer-1干预后,细胞形态接近正常,突触较模型组变长（P<0.05）。3.酶标仪结果显示:H/R组和erastin组的LDH水平与正常对照组相比,显著升高（P<0.05）;H/R+Sen组、H/R+Fer-1组、erastin+Sen组和erastin+Fer-1组的LDH水平与模型组相比,显著降低（P<0.05）。初步证实H/R细胞模型中存在铁死亡,且Sen干预后能缓解这种损伤,后续将进一步探讨Sen对H/R细胞模型中铁死亡发生的可能机制。第二部分:Sen对H/R诱导PC12细胞铁死亡的影响及机制1.酶标仪结果显示:H/R组和erastin组与对照组相比,细胞内铁离子水平显著升高,GSH和GSH-Px水平显著降低（P<0.05）;加入Sen和Fer-1交叉干预后,与模型组相比,铁离子水平显著降低,GSH和GSH-Px水平显著升高（P<0.05）。2.荧光探针DCFH-DA标记结果显示:H/R组和erastin组与对照组相比,活细胞内ROS水平显著升高（P<0.05）;加入Sen和Fer-1交叉干预后,与模型组相比,ROS积累水平显著降低（P<0.05）。3.荧光探针JC-1染色结果显示:H/R组和erastin组与对照组相比,活细胞内△Ψm水平显著降低（P<0.05）;加入Sen和Fer-1交叉干预后,与模型组相比,活细胞内△Ψm水平显著升高（P<0.05）。4.Western blotting检测结果显示:H/R组和erastin组与对照组相比,ACSL4蛋白表达升高,GPX4和SLC7A11蛋白表达降低（P<0.05）;加入Sen和Fer-1交叉干预后,与模型组相比,ACSL4蛋白表达降低,GPX4和SLC7A11蛋白表达升高（P<0.05）。结论:1.成功构建了缺氧/复氧（缺氧12小时,复氧2小时）损伤细胞模型和erastin诱导铁死亡（10μmol/l erastin作用14小时）细胞模型,筛选出Sen和Fer-1最佳工作浓度（Sen:60μmol/l,Fer-1:5μmol/l）;2.PC12细胞缺氧/复氧损伤过程中存在铁死亡。远志皂苷元（Sen）可抑制铁死亡,发挥保护细胞的作用,其机制可能与其增强细胞清除氧自由基的能力、降低细胞内铁离子水平、上调GPX4蛋白表达等有关;交叉干预的结果提示Sen的这一作用与铁死亡抑制剂Fer-1保护作用相似。