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背景:多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是一种常见的中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)自身免疫性炎症疾病。血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的破坏和随后自身反应性T淋巴细胞的浸润是多发性硬化症及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的主要病理特征。据报道,大量活化的Th17细胞是血脑屏障破坏和神经元退行性变化的主要原因,而Kvl.3通道在Th17细胞的活化过程中起关键作用。Kvl.3通道抑制剂作为MS潜在的治疗药物,目前为止,其作用机制多集中在免疫抑制调控方面,而关于血脑屏障保护方面的研究较少。在本课题组前期研究工作中,我们筛选出了具有较高活性和选择性的Kvl.3通道抑制剂多肽ImKTx88,其对MS患者和EAE大鼠都具有潜在的治疗作用。本研究将进一步探究ImKTx88对EAE诱导大鼠BBB损伤的保护效应和分子机制,为MS的预防与治疗提供理论和实验依据。目的:阐明高选择性的Kvl.3通道抑制剂多肽ImKTx88对MS的治疗作用,探讨其在EAE大鼠模型中对BBB的保护作用及其机制。方法:(1)选取6-8周龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分为正常对照组(Control组)、模型组(EAE组)、预防给药组(Prevention组)和治疗组(Treatment组)。通过足垫皮内注射自身免疫性抗原诱导大鼠EAE模型。其中Prevention组第0-23天每天皮下注射100μg/kgImKTx88,Treatment组第12-23天每天皮下注射100μg/kg ImKTx88,Control组和EAE组每天给予等量PBS处理,每日观察并记录各组大鼠行为学变化,第23天取材进行苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)和坚牢蓝(Luxol fast blue,LFB)染色,观察大鼠小脑组织病理学变化。(2)大鼠血脑屏障通透性检测。各组大鼠尾静脉注射伊文氏蓝(Evans Blue)染料,体内循环lh后,甲酰胺萃取小脑和腰骶膨大组织中渗漏的伊文氏蓝染料,用来评估血脑屏障的通透性。(3)RT-qPCR和Western blot(WB)分别检测各组大鼠小脑组织中紧密连接复合物(Occludin、ZO-1、Claudin-5)基因和蛋白的表达,免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)检测其形态的变化以及小脑组织中的分布:WB和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)分别检测各组大鼠小脑组织中黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)蛋白的表达和分布。(4)RT-qPCR和WB检测各组大鼠小脑组织中血管生成素1(Angiopoietin-1,Ang-1)及其特异性受体Tie-2基因和蛋白的表达。(5)RT-qPCR和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测各组大鼠小脑组织中IL-17基因和蛋白的表达;T细胞体外激活实验进一步探究Kvl.3抑制剂ImKTx88对Thl7细胞激活的抑制作用,ELISA检测外周活化T细胞上清中IL-17的表达。结果:(1)行为学评分结果发现,与EAE组相比,Prevention组和Treatment组均能够有效的降低EAE组大鼠的行为学评分。HE和LFB结果发现,与Control组相比,EAE组大鼠小脑白质区域出现大量炎性细胞的浸润和髓鞘的缺失,ImKTx88能够减少炎性细胞的中枢浸润和脱髓鞘的发生。(2)伊文氏蓝结果表明,与Control组相比,EAE组大鼠脑部和脊髓的伊文氏蓝染料渗透量增加,ImKTx88能够减少伊文氏蓝染料的中枢渗透。(3)RT-qPCR和WB结果显示,与Control组相比,EAE组大鼠小脑白质区域紧密连接复合物(Occludin、ZO-1和Claudin-5)在mRNA和蛋白水平的表达明显下调,IF结果发现Claudin-5出现分布异常,ImKTx88能够明显上调紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-5的表达,同时逆转Claudin-5的异常分布。IHC结果显示,与Control组相比,EAE组大鼠小脑白质区域黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达明显增加;ImKTx88 明显减少黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达和分布。(4)RT-qPCR和WB结果表明,与Control组相比,EAE组大鼠小脑白质组织中Ang-l/Tie-2轴的mRNA和蛋白表达下调,而ImKTx88可以促进EAE大鼠小脑Ang-1/Tie-2轴的表达。(5)体内实验结果表明ImKTx88能够抑制EAE大鼠小脑组织中炎性因子IL-17的基因和蛋白的表达水平;体外T细胞激活实验进一步验证了 ImKTx88能够减少外周活化T细胞中炎性因子IL-17的表达。结论:ImKTx88能够有效地缓解EAE大鼠疾病的发生并且对血脑屏障的破坏起到保护作用:一方面,ImKTx88通过增加紧密连接蛋白的表达以及修复紧密连接蛋白的异常分布,保护血脑屏障的完整性;另一方面,ImKTx88通过抑制黏附分子的表达,减少内皮细胞的活化,从而减少炎性细胞的黏附和迁移。进一步研究发现,ImKTx88可能是通过阻断Kvl.3通道继而抑制Th17激活,增加Ang-1/Tie-2的表达来发挥上述血脑屏障的保护作用。因此,ImKTx88对多发性硬化症的新药研发有重要价值。