论文部分内容阅读
大豆的生长发育同外界环境紧密相关,环境中的许多非生物因素如干旱、盐碱、冰冻、低温等胁迫会影响大豆的生长发育,严重时甚至会导致大豆的产量大幅度减产。利用转基因技术增强大豆的抗逆性,培育一批具有较强抗逆性的大豆新品系,对解决我国的产业危机具有十分重要的意义。本实验利用采集于浙江滩涂的盐地碱蓬种子,在浙江省农科院作物与核技术利用研究所温室大棚的塑料盆内培育,连续浇以6%的NaCl溶液进行胁迫处理,提取盐地碱蓬总RNA,反转录成cDNA,然后进行基因克隆,获得目的基因片段,并利用TAIL PCR技术获得目的基因3’和5’端序列。将目的基因构建到含Bar标记基因的pBA002植物表达载体中,利用热激发将其导入农杆菌EHA105中。然后利用农杆菌介导法,以胚尖和带一片子叶的胚尖作为遗传转化体系的外植体,对大豆进行转基因研究。同时,还研究了外源甜菜碱和NaCl对大豆苗期的影响。实验取得了如下主要研究成果：1、从盐地碱蓬中克隆了一个在甜菜碱合成过程中起关键作用的胆碱单加氧酶(CMO)基因。基因全长2260bp,包括564bp的5’端、1332bp的CDS和364bp的3’端。该基因编码443个氨基酸,由二十种氨基酸组成,其中含的Ser、Thr、Val较多,Met最少。通过对SsCMO蛋白与其它CMO蛋白的多序列比对,发现SsCMO蛋白氨基酸序列在162-167区域和290-296区域存在两个十分保守的序列。同时通过构建系统进化树,显示了辽宁碱蓬SlCMO与盐地碱蓬SsCMO具有最高同源性。2、在克隆载体质粒pTA2-SsCMO的基础上,利用双酶切,将SsCMO基因从克隆载体中分离出来,与植物表达载体pBA002进行了连接,构建了既含Bar标记基因又含SsCMO目的基因的双元植物表达载体,利用热激法导入农杆菌EHA105中。利用农杆菌介导法对大豆品种‘浙春3号’和‘南农88-31’进行了遗传转化研究,对转基因苗涂抹10mg/L Basta进行初筛,然后提取大豆叶片总DNA,对目的基因进行PCR扩增,并对T-DNA区域构建特异性的PCR检测,结果显示T0分别获得28个转基因株系,平均转化率为1.2%。3、以大豆品种‘浙春3号’为研究材料,在苗期施加外源甜菜碱和NaCl,通过生理生化指标的分析,发现施加400mg·L-1的外源甜菜碱可以显著增加叶片光合色素和可溶性糖的含量,减少脯氨酸、丙二醛的积累,降低叶片的相对电导率,增强了豆苗的根系活力;说明施加合适浓度的外源甜菜碱可以提高植株叶片的光合活性,增强大豆幼苗的渗透调节能力,缓解NaCl胁迫引起的伤害,进而提高植株的耐盐性。