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前言TSG101(Tumor Susceptibility Gene101)蛋白近年被发现与多种肿瘤均有关,且常被检测出有异常剪切子存在,但其在肿瘤发生、发展中的作用尚未完全明确。可是此蛋白作为内吞分选通路的重要因子,可以影响多种蛋白的内吞降解。一旦此通路异常,便会使内吞的囊泡受阻于运往溶酶体降解的途中,进而增加蛋白被异常激活或循环再利用的几率,造成细胞生长中的信号紊乱。而Notch受体信号家族成员是利用此通路调节信号平衡的典型代表,正常情况下内吞分选过程参与调节他们在不同时间、不同空间下的信号平衡,确保细胞分化、增殖的正常进行。有文献报道果蝇中TSG101蛋白同源物的异常阻碍了Notch受体的降解,进而信号表达增多,出现果蝇胚基的异常增殖。而在哺乳动物组织中Notch受体有4种亚型,在人类许多肿瘤中均发现有不同亚型的异常表达,且常是在信号数量上的变化。而在肺组织中Notch3亚型受体被证实是对肺组织分化、发育和损伤修复起突出作用的亚型。那么本研究旨在初步探讨肺癌中TSG101蛋白和Notch3受体的表达情况,及两者表达的可能相关性。材料与方法1、材料收集65例肺癌组织(鳞癌38例,腺癌27例),另外24例新鲜肺癌组织及26例新鲜癌旁正常肺组织取自中国医科大学附属第一临床医院。6株肺癌细胞系(SK为肺鳞癌细胞系;BE1为肺巨细胞癌细胞系;460为肺大细胞癌细胞系;LTE和SPC为肺腺癌细胞系;446为肺小细胞癌细胞系)。2、主要试剂和来源浓缩型鼠抗人T SG101蛋白单克隆抗体(sc-7964),兔抗人Notch3受体多克隆抗体(sc-5593)均购自Santa Cruz公司。3、方法(1)免疫组织化学技术蜡块标本切片后按照链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(SP法)检测TSG101蛋白(1:200)和Notch3受体(1:200)表达。孔板爬片细胞固定、打孔后,按照SP法检测Notch3受体(1:200)表达。以磷酸缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。(2)Western blot技术总蛋白从生长到对数期收集的细胞及组织中提取。SDS-PAGE电泳,TSG101蛋白80 v恒压4℃湿转2 h,Notch3受体200 mA恒流4℃湿转500 min。TBS/0.3%Tween-20/5%小牛血清室温封闭2hrs,一抗(1:400)4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2 h。Notch3受体内参β-actin在电泳后以切胶方式与Notch3受体所在部位分开转印。ECL显色,X线胶片曝光成像。(3)抗体封闭技术癌细胞状态良好时,传代3批次。无血清培养基1640饥饿8h后,分别不加抗体、加入与TSG101蛋白抗体同源的无关IgG作为对照,加入TSG101蛋白抗体,均孵育48 h。以Western Blot和免疫细胞化学方法检测抗体封闭TSG101蛋白功能后,Notch3受体表达情况。4、统计学分析应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,采用x 2检验分析各组计数资料,采用Spearman等级相关分析TSG101蛋白与Notch3受体表达的关系,采用t检验分析Western blot图像灰度值,细胞组化积分光密度值,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、免疫组织化学结果TSG101蛋白表达主要定位于细胞浆,少量定位于细胞核。在正常肺组织中染色强于肺鳞癌和肺腺癌。Notch3受体主要定位于细胞膜、细胞浆、细胞核。在正常肺组织染色弱于肺鳞癌和肺腺癌。两者表达水平均与肺癌组织分化(P＜0.05)、淋巴结转移(P＜0.05)明显相关。TSG101蛋白表达与Notch3受体表达呈负相关(P＜0.05)。用TSG101蛋白抗体封闭SPC细胞中TSG101蛋白功能后Notch3受体的免疫细胞化学结果显示胞浆中Notch3受体染色有增强。2、Western Blot结果TSG101蛋白在癌组织及细胞系中的表达明显低于正常肺组织及细胞系,Notch3受体在癌组织及细胞系中的表达则明显高于正常。用TSG101蛋白抗体封闭腺癌细胞系SPC中TSG101蛋白功能后Notch3受体检测水平较对照组有增高。结论肺癌中TSG101蛋白表达下调,与Notch3受体检测水平的上升有相关性。