背景鼠双微基因2（mouse double minute 2,MDM2）是p53最重要的负性调控因子,它通过与p53形成一个自动调节反馈环调控p53蛋白的稳定性和活性,进而调节肿瘤的发生发展。研究显示MDM2抑制剂Nutlin-3a在多种肿瘤中具有良好的抗肿瘤效应。同时,近期研究发现,内质网应激可诱导细胞凋亡并参与调控癌细胞的药物敏感性。本课题将从细胞凋亡和内质网应激的角度切入,深入探索MDM2抑制剂Nutlin-3a的抗肿瘤及调节结肠癌化疗敏感性的可能机制。目的1.明确MDM2抑制剂Nutlin-3a对结肠癌细胞存活、增殖及凋亡的影响。2.探讨内质网应激在Nutlin-3a诱导结肠癌细胞凋亡发生的机制。3.明确Nutlin-3a对结肠癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法1.体外培养结肠癌细胞RKO、HCT116和LOVO,采用CCK-8法检测细胞存活率;2.平板克隆形成实验检测结肠癌细胞增殖能力;流式细胞术检测结肠癌细胞凋亡率;3.利用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测结肠癌细胞内线粒体膜电位变化;4.利用Western blotting检测线粒体凋亡相关蛋白、内质网应激相关蛋白以及死亡受体相关蛋白的表达;5.利用实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative PCR,RT-PCR）检测外源性凋亡途径相关基因m RNA水平的变化;6.钙离子荧光探针Fluo-4 AM检测不同时间不同浓度Nutlin-3a对结肠癌细胞内钙离子浓度的变化。7.利用结肠癌细胞构建裸鼠皮下瘤模型,随机分配后应用不同药物治疗,观察并记录荷瘤小鼠皮下瘤生长速度、重量;8.利用TUNEL法检测结肠癌组织石蜡切片中凋亡情况。结果1.Nutlin-3a可显著减少结肠癌细胞存活、增殖能力,诱导肠癌细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8的剪切体的激活。敲低Caspase-8可显著减轻Nutlin-3a诱导的结肠癌细胞凋亡作用。2.Nutlin-3a可显著上调死亡受体通路相关基因表达,其中,在三种结肠癌细胞中,死亡受体5（DR5）蛋白的上调最显著。干扰DR5可有效抵消Nutlin-3a诱导结肠癌细胞凋亡的作用并减少Nutlin-3a激活的Caspase-3和Caspase-8剪切体的形成。3.Nutlin-3a可显著降低P53突变型结肠癌细胞存活率、诱导其发生凋亡,同时上调其DR5基因及蛋白表达。干扰DR5可效抵消Nutlin-3a对P53突变型结肠癌细胞存活率的影响并显著减少Nutlin-3a激活的Caspase-3和Caspase-8剪切体的形成。4.Nutlin-3a可显著上调内质网应激相关蛋白BIP、P-EIF-2α、ATF4、CHOP、XBP1α的表达。干扰CHOP可减轻Nutlin-3a引起的结肠癌细胞凋亡、减少Nutlin-3a诱导的DR5、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-8的表达。Nutlin-3a可以呈时间依赖以及浓度依赖性增加结肠癌细胞内钙离子浓度。利用钙离子螯合剂BAPTA作用结肠癌细胞可有效降低Nutlin-3a引起的钙离子浓度并减轻Nutlin-3a诱导的内质网应激相关蛋白和基因的表达。5.体内外实验证明,Nutlin-3a联合应用内质网应激激活剂Tunicamycin/Thapsigargin可显著减小肿瘤体积,诱导肿瘤细胞凋亡。Nutlin-3a联合化疗药物5FU/TRAIL可显著增加化疗药物的抗肿瘤效果,诱导肿瘤细胞凋亡。结论Nutlin-3a可以诱导结肠癌细胞内质网应激的发生,从而通过内质网应激相关CHOP调控DR5诱导结肠癌细胞凋亡,并增强结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。