目的:急性肝损伤（Acute liver injury,ALI）起病急,进展快,若控制不良可导致病情迅速恶化,引发不良预后的发生。肝损伤的预后取决于炎症的消退以及肝细胞的再生,这一过程受多种内外因素的影响,昼夜节律紊乱（Circadian rhythm disorder,CD）也参与其中。本研究拟通过建立昼夜节律紊乱合并肝损伤小鼠模型,评估节律紊乱对急性肝损伤严重程度的影响。随后探讨TGF-β/Smad信号介导的非细胞自主性衰老在这一过程中发挥的作用。最后通过药物干预的手段,研究TGF-β受体Ⅰ抑制剂对节律紊乱合并肝损伤小鼠的潜在治疗效果。为后续优化急性肝损伤患者的治疗及临床管理提供新的视角。方法:1、探究节律紊乱合并肝损伤小鼠模型的构建条件。通过持续光照法构建CD小鼠模型,并从小鼠一般情况、行为学改变及肝组织生物钟基因m RNA水平变化三个方面对该模型的有效性进行评估鉴定。同时,通过建立D-Gal N/LPS剂量梯度（200/2.5、400/5、800/10）,构建三种不同程度的ALI小鼠模型,确定实验条件下ALI造模药物的最适剂量。2、探讨TGF-β/Smad信号通路在节律紊乱合并急性肝损伤中的作用。通过持续光照联合D-Gal N/LPS腹腔注射法构建节律紊乱合并急性肝损伤小鼠模型,观察并对比对照组（Control）、节律紊乱组（CD）、急性肝损伤组（ALI）及节律紊乱合并肝损组（CD+ALI）小鼠的生存情况,采用干化学法检测血清转氨酶、ELISA法检测血清IL-6、TNF-α水平、组织形态学检查及TUNEL荧光染色等方式,对各组小鼠的肝损伤严重程度进行对比。通过q RT-PCR及Western-blot检测肝组织内P53、P21、γ-H2AX、细胞衰老相关分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype,SASP）等细胞衰老相关组分的转录表达水平,细胞衰老β-半乳糖苷酶（Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal）染色法评估肝内细胞衰老水平。同时,检测CD+ALI小鼠肝组织TGF-β/Smad信号组分的表达情况,并采用P53/P21双标免疫荧光染色法验证非细胞自主性衰老现象的存在。通过在多时间点采用q RT-PCR法检测CD小鼠TGF-β1 m RNA水平,寻找节律紊乱调控细胞衰老的潜在原因。3、探索TGF-β受体Ⅰ抑制剂干预的治疗效果。在CD小鼠成模后,肝损伤造模前给予TGF-β受体Ⅰ抑制剂干预,随后通过上述方法检测小鼠肝损伤严重程度及肝内细胞衰老水平,进一步评估TGF-β1信号抑制在节律紊乱合并肝损伤中的潜在治疗价值。结果:1、持续光照联合400 mg/kg D-Gal N+5μg/kg LPS腹腔注射可用于构建节律紊乱合并急性肝损伤小鼠模型。采用持续光照1个月的方法可导致小鼠出现显著的行为学改变,同时小鼠肝组织节律相关基因clock、bmal1、nr1d1、per1、per2、per3、及cry1的节律性发生明显变化,提示CD小鼠模型构建成功。通过剂量梯度干预实验,我们发现在400 mg/kg的D-Gal N与5μg/kg LPS联合腹腔注射下,小鼠于给药结束后5.5小时开始出现小鼠死亡,72小时生存率可达50%左右。炎症高峰期血清ALT、AST较Control组显著升高,肝组织镜下可见肝小叶结构紊乱,肝板断裂,肝细胞水肿及点状坏死,肝血窦内出血明显,并存在炎症细胞浸润。与ALI组小鼠相比,CD+ALI小鼠表现出更严重的肝损伤表型,该组于给药结束后4.5小时出现死亡事件,72小时生存率仅20%。炎症高峰期血清ALT、AST及IL-6、TNF-α水平较ALI组均显著升高（P<0.01）。CD+ALI小鼠肝组织HE染色结果显示,该组发生水肿及坏死的肝细胞较ALI组更多,肝窦内出血及炎症细胞浸润现象更为明显,同时TUNEL阳性的死亡细胞数量更多,分布更广。2、细胞衰老水平在CD+ALI小鼠肝组织中显著上调,同时存在TGF-β/Smad信号激活。在CD+ALI小鼠肝组织中,细胞衰老相关组分p21、TGF-β1、IL-1α及cyclin E转录水平较ALI组均有显著上调,cyclin D m RNA水平下降。P21、Cyclin D、Cyclin E蛋白表达水平与转录水平变化情况一致,γ-H2AX较ALI组显著升高,P53及其磷酸化、乙酰化蛋白水平虽较Control组有所升高,但与ALI组之间无显著差异。在CD+ALI组,SA-β-gal染色阳性区域较前两组更加密集。3、TGF-β受体Ⅰ抑制剂可有效减轻CD+ALI小鼠肝损伤程度及肝内细胞衰老水平。在TGF-β受体Ⅰ抑制剂干预下,节律紊乱合并肝损伤小鼠生存率较CD+ALI更高,ALT、AST及IL-6、TNF-α水平也显著降低（P<0.01）。肝组织内TGF-β/Smad信号激活水平受到显著抑制,同时肝内细胞衰老相关组分P21、TGF-β1、IL-1α及Cyclin E较ALI组均有显著降低,Cyclin D回升,提示细胞衰老现象的改善。结论:持续光照诱导的昼夜节律紊乱可导致肝损伤预后不良。节律紊乱可能通过TGF-β/Smad介导的非细胞自主性衰老途径影响肝损伤预后。TGF-β受体Ⅰ抑制剂LY2157299可有效改善节律紊乱合并肝损伤小鼠肝内细胞衰老现象,并减轻肝损伤严重程度。