论文部分内容阅读
胃癌是全球常见恶性肿瘤，严重威胁人类健康。2015年全球胃癌新发病例约100万，死亡病例高达74.5万。中国是胃癌高发国家，胃癌在中国的发病率和死亡率均是世界平均水平的两倍多。目前与胃癌发病相关的已知因素包括：胃幽门螺杆菌感染、肠道微生物、炎性微环境、遗传学和表观遗传学变化等。其中遗传学与表观遗传学变化通常由基因突变、异常甲基化或分子多态性引起。
DNA甲基转移酶2(DNMT2)属于DNA甲基转移酶家族，主要作用于真核生物转运RNA(tRNA)的反密码子环，甲基化38位胞嘧啶(C38)的第5位碳原子，生成5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine, m5C)。文献报道，DNMT2分子多态性rs11254413导致DNMT2蛋白形成H101Y位置的氨基酸改变(Gene Variant)，与中国南方汉族人胃癌发病显著相关。但是，DNMT2与胃癌关联的分子机制在国际国内尚未见报道。
本论文选取人癌旁及胃癌组织，分析了这些组织中DNMT2的序列及其表达特征；并以正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1)和胃癌细胞株(SGC7901)为研究对象，利用分子生物学和细胞生物学的手段，探讨了野生型DNMT2及H101Y变体对细胞增殖、迁移与侵袭的影响及分子机制。本论文的研究结果如下：
1.DNMT2在癌旁及胃癌组织中的序列及分布特征
对临床获得的23对癌旁及胃癌组织的DNMT2编码序列测序结果显示，H101Y变体比例占13.04%，与文献报道一致。
对临床癌旁与胃癌组织的免疫组化染色分析DNMT2的表达特征发现，胃癌组织与癌旁组织相比多为不规则结构，癌细胞数量多，结缔组织所占比例增大且有大量淋巴细胞浸润，其中存在多个形状不规则的胃腺，组织内含很多微血管；H101Y变体癌旁组织与野生型DNMT2癌旁组织相比，胃间质中有更多的淋巴细胞浸润，且癌组织中有更多的嗜酸性粒细胞，说明H101Y突变型患者在胃癌发生过程中能引发更强烈的免疫反应，但胃癌细胞更倾向于迁移运动。H101Y变体影响DNMT2在胃癌组织中的定位，DNMT2在细胞核和细胞质中都有表达，在细胞核中表达高于细胞质中的表达。在野生型DNMT2病人的胃腺中，癌旁组织DNMT2表达高于癌组织；而在结缔组织中，癌旁组织DNMT2表达低于癌组织。在DNMT2-H101Y变体的癌症病人胃腺中，癌旁组织DNMT2表达同样高于癌组织；而结缔组织中，DNMT2表达规律与野生型DNMT2病人相反。
2.DNMT2对GES-1与SGC7901细胞活力和迁移的影响
利用MTT法检测GES-1和SGC7901的细胞活力发现，与转染了空载质粒的对照细胞组相比，过表达DNMT2或H101Y变体对细胞活力影响不显著，说明DNMT2与H101Y变体对正常胃黏膜上皮细胞GES-1与胃癌细胞SGC7901的增殖无显著影响；
利用小室迁移实验(Transwell )和划痕愈合实验检测细胞迁移发现，过表达DNMT2和H101Y均可以促进GES-1细胞的迁移；过表达DNMT2显著抑制SGC7901细胞的迁移，过表达H101Y对SGC7901细胞的迁移无影响。
3.过表达H101Y变体对胃癌细胞SGC7901转录组的影响
为了探讨H101Y变体在胃癌发生过程中的作用机制，采用RNA-seq方法对转染了pcDNA3.1(对照组)和过表达H101Y变体(实验组)的胃癌细胞SGC7901进行了转录组测序分析。
结果显示：(1)RNA样本的数据碱基质量合格；(2)GO注释结果表明，测序发现与分子功能相关的基因有18277个，参与生物过程的基因有16546个，与细胞定位相关的基因有18148个；KEGG注释结果显示，差异的基因与细胞群落、细胞运输和分解代谢、信号传导、信号分子和互作、癌症等相关。对照组于实验组表达变化显著的基因多富集在与细胞间相互作用、细胞代谢、癌症、传染病、内分泌及免疫系统的信号通路中；(3)对照组和实验组相比基因表达有显著性差异的总共有184个，表达下降显著的基因有45个，表达上升显著的基因有139个；(4)KEGG富集分析表明，与对照组相比，H101Y突变组差异基因富集的KEGG通路主要有细胞外基质受体信号通路；低氧诱导因子信号通路；糖代谢和糖酵解相关通路；癌症相关信号通路等。
4.DNMT2和H101Y变体对GES-1细胞中细胞外基质受体(ECM-receptor)信号通路的影响
为了进一步验证转录组分析的结果，并揭示DNMT2和H101Y变体影响细胞迁移的分子机制，利用qRT-PCR和WesternBlot的方法检测空载对照组、过表达DNMT2组及H101Y变体组GES-1细胞中ECM-receptor信号通路相关差异基因的表达，同时用siRNA敲降DNMT2并过表达H101Y的方法验证，并对癌旁及胃癌组织进行免疫组化染色分析。
通过对qRT-PCR结果、WesternBlot结果和敲降DNMT2的结果及免疫组化结果综合分析得出，GES-1细胞中DNMT2和H101Y可能通过ITGB1，ITGB4和MMP2影响细胞迁移。三个组中ITGB1的表达为先下降后上升的趋势；ITGB4的表达为先上升后下降的趋势；MMP2的表达为DNMT2组无显著变化而H101Y组显著上升的趋势。
5.DNMT2和H101Y变体对SGC7901细胞中ECM-receptor信号通路的影响
用同样的方法分析SGC7901细胞中迁移因子的变化得出，SGC7901细胞中，DNMT2和H101Y可能通过ITGB3，MMP9和MMP12影响细胞的迁移。SGC7901中DNMT2能够使细胞中的ITGB3表达下降，H101Y使其表达升高，MMP9和MMP12的表达逐渐下降，因此可以得出DNMT2是通过降低细胞中的ITGB3、MMP9和MMP12的表达来抑制细胞的迁移活动的。
6.DNMT2的多种癌症变体对GES-1细胞增殖与迁移的影响
本论文分析了文献报道中提出的另外15种DNMT2癌症变体对GES-1和SGC7901细胞增殖与迁移的影响。这些癌症变体包括：E63K,G155S,G155C,G155V,E185D,E185K,E202V,E202Q,D226Y,D226H,L257I,L257V,E317G,E317D,R371H，利用定点突变方法构建。采用细胞计数、MTT、Transwell小室迁移实验和划痕愈合实验观察过表达DNMT2和15种癌症变体对两种细胞增殖与迁移的影响。
将野生型DNMT2和15种癌变体转染到GES-1细胞中，发现细胞计数和MTT结果没有显著性差异；Transwell结果显示过表达DNMT2显著促进细胞迁移，过表达癌变体后GES-1细胞的迁移几乎都被抑制；划痕愈合结果显示，大部分癌变体都抑制GES-1细胞迁移，只有野生型DNMT2组、E63K和E185D促进细胞的迁移。正常细胞GES-1中，除了E202Q/V和L257I这三个突变体以外的突变体对细胞划痕愈合的影响与DNMT2酶活结果(李华日,2018,未发表数据)一致。
7.DNMT2的多种癌症变体对SGC7901细胞增殖与迁移的影响
结果显示，将野生型DNMT2和15种癌变体转染到SGC7901细胞中，发现细胞计数和MTT结果没有显著性差异；G155S/C/V、E185K、D226Y/H、L257I/V、E317G/D和R371H等癌症变体促进SGC7901细胞迁移，与DNMT2酶活结果相反；使DNMT2酶活性升高的癌症变体如E185D则抑制SGC7901细胞迁移；细胞划痕实验结果显示，G155C/V、D226H、E317G/D使DNMT2的酶活性降低，同时促进SGC7901细胞的迁移；E63K、E202V和L257I使DNMT2的酶活性升高，同时抑制SGC7901细胞的迁移；R371H和D226Y对DNMT2酶活性下调的最显著，过表达R371H和D226Y48h后，SGC7901部分细胞出现死亡。
综合上述研究结果，本研究论文得到的结论如下：
A．DNMT2的H101Y癌症变体在本论文所检测的胃癌患者样品中所占比例达13.04%；H101Y改变细胞中DNMT2蛋白的定位，并导致胃癌组织中淋巴细胞浸润增多，可能与胃癌的转移和预后相关。
B．首次揭示DNMT2-H101Y变体参与胃癌细胞系SGC7901中的信号通路变化，ECM-receptor信号通路的变化影响胃癌细胞的迁移；对ECM-receptor信号通路相关因子的验证发现，DNMT2和H101Y参与胃癌细胞上的ECM受体与细胞外基质的相互作用。揭示了DNMT2和H101Y能够通过调节MMP2、ITGB1和ITGB4的蛋白表达并与ECM相互作用而促进或抑制GES-1细胞的迁移；通过调节MMP9、MMP12和ITGB3的表达影响SGC7901细胞的迁移。
C．其他DNMT2癌变体对GES-1和SGC7901细胞系的生长和迁移有促进或抑制的作用。使DNMT2的酶活降低的变体能促进胃癌细胞的迁移，反之使DNMT2酶活升高的变体则抑制胃癌细胞的迁移。间接证明DNMT2通过参与调节胃癌细胞系的生长和运动来影响癌症细胞的迁移活动。
本论文的研究结果揭示了DNMT2的H101Y变体在胃癌发病过程中的功能机制，为胃癌的早期诊断和干预提供了潜在的新靶点。
DNA甲基转移酶2(DNMT2)属于DNA甲基转移酶家族，主要作用于真核生物转运RNA(tRNA)的反密码子环，甲基化38位胞嘧啶(C38)的第5位碳原子，生成5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine, m5C)。文献报道，DNMT2分子多态性rs11254413导致DNMT2蛋白形成H101Y位置的氨基酸改变(Gene Variant)，与中国南方汉族人胃癌发病显著相关。但是，DNMT2与胃癌关联的分子机制在国际国内尚未见报道。
本论文选取人癌旁及胃癌组织，分析了这些组织中DNMT2的序列及其表达特征；并以正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1)和胃癌细胞株(SGC7901)为研究对象，利用分子生物学和细胞生物学的手段，探讨了野生型DNMT2及H101Y变体对细胞增殖、迁移与侵袭的影响及分子机制。本论文的研究结果如下：
1.DNMT2在癌旁及胃癌组织中的序列及分布特征
对临床获得的23对癌旁及胃癌组织的DNMT2编码序列测序结果显示，H101Y变体比例占13.04%，与文献报道一致。
对临床癌旁与胃癌组织的免疫组化染色分析DNMT2的表达特征发现，胃癌组织与癌旁组织相比多为不规则结构，癌细胞数量多，结缔组织所占比例增大且有大量淋巴细胞浸润，其中存在多个形状不规则的胃腺，组织内含很多微血管；H101Y变体癌旁组织与野生型DNMT2癌旁组织相比，胃间质中有更多的淋巴细胞浸润，且癌组织中有更多的嗜酸性粒细胞，说明H101Y突变型患者在胃癌发生过程中能引发更强烈的免疫反应，但胃癌细胞更倾向于迁移运动。H101Y变体影响DNMT2在胃癌组织中的定位，DNMT2在细胞核和细胞质中都有表达，在细胞核中表达高于细胞质中的表达。在野生型DNMT2病人的胃腺中，癌旁组织DNMT2表达高于癌组织；而在结缔组织中，癌旁组织DNMT2表达低于癌组织。在DNMT2-H101Y变体的癌症病人胃腺中，癌旁组织DNMT2表达同样高于癌组织；而结缔组织中，DNMT2表达规律与野生型DNMT2病人相反。
2.DNMT2对GES-1与SGC7901细胞活力和迁移的影响
利用MTT法检测GES-1和SGC7901的细胞活力发现，与转染了空载质粒的对照细胞组相比，过表达DNMT2或H101Y变体对细胞活力影响不显著，说明DNMT2与H101Y变体对正常胃黏膜上皮细胞GES-1与胃癌细胞SGC7901的增殖无显著影响；
利用小室迁移实验(Transwell )和划痕愈合实验检测细胞迁移发现，过表达DNMT2和H101Y均可以促进GES-1细胞的迁移；过表达DNMT2显著抑制SGC7901细胞的迁移，过表达H101Y对SGC7901细胞的迁移无影响。
3.过表达H101Y变体对胃癌细胞SGC7901转录组的影响
为了探讨H101Y变体在胃癌发生过程中的作用机制，采用RNA-seq方法对转染了pcDNA3.1(对照组)和过表达H101Y变体(实验组)的胃癌细胞SGC7901进行了转录组测序分析。
结果显示：(1)RNA样本的数据碱基质量合格；(2)GO注释结果表明，测序发现与分子功能相关的基因有18277个，参与生物过程的基因有16546个，与细胞定位相关的基因有18148个；KEGG注释结果显示，差异的基因与细胞群落、细胞运输和分解代谢、信号传导、信号分子和互作、癌症等相关。对照组于实验组表达变化显著的基因多富集在与细胞间相互作用、细胞代谢、癌症、传染病、内分泌及免疫系统的信号通路中；(3)对照组和实验组相比基因表达有显著性差异的总共有184个，表达下降显著的基因有45个，表达上升显著的基因有139个；(4)KEGG富集分析表明，与对照组相比，H101Y突变组差异基因富集的KEGG通路主要有细胞外基质受体信号通路；低氧诱导因子信号通路；糖代谢和糖酵解相关通路；癌症相关信号通路等。
4.DNMT2和H101Y变体对GES-1细胞中细胞外基质受体(ECM-receptor)信号通路的影响
为了进一步验证转录组分析的结果，并揭示DNMT2和H101Y变体影响细胞迁移的分子机制，利用qRT-PCR和WesternBlot的方法检测空载对照组、过表达DNMT2组及H101Y变体组GES-1细胞中ECM-receptor信号通路相关差异基因的表达，同时用siRNA敲降DNMT2并过表达H101Y的方法验证，并对癌旁及胃癌组织进行免疫组化染色分析。
通过对qRT-PCR结果、WesternBlot结果和敲降DNMT2的结果及免疫组化结果综合分析得出，GES-1细胞中DNMT2和H101Y可能通过ITGB1，ITGB4和MMP2影响细胞迁移。三个组中ITGB1的表达为先下降后上升的趋势；ITGB4的表达为先上升后下降的趋势；MMP2的表达为DNMT2组无显著变化而H101Y组显著上升的趋势。
5.DNMT2和H101Y变体对SGC7901细胞中ECM-receptor信号通路的影响
用同样的方法分析SGC7901细胞中迁移因子的变化得出，SGC7901细胞中，DNMT2和H101Y可能通过ITGB3，MMP9和MMP12影响细胞的迁移。SGC7901中DNMT2能够使细胞中的ITGB3表达下降，H101Y使其表达升高，MMP9和MMP12的表达逐渐下降，因此可以得出DNMT2是通过降低细胞中的ITGB3、MMP9和MMP12的表达来抑制细胞的迁移活动的。
6.DNMT2的多种癌症变体对GES-1细胞增殖与迁移的影响
本论文分析了文献报道中提出的另外15种DNMT2癌症变体对GES-1和SGC7901细胞增殖与迁移的影响。这些癌症变体包括：E63K,G155S,G155C,G155V,E185D,E185K,E202V,E202Q,D226Y,D226H,L257I,L257V,E317G,E317D,R371H，利用定点突变方法构建。采用细胞计数、MTT、Transwell小室迁移实验和划痕愈合实验观察过表达DNMT2和15种癌症变体对两种细胞增殖与迁移的影响。
将野生型DNMT2和15种癌变体转染到GES-1细胞中，发现细胞计数和MTT结果没有显著性差异；Transwell结果显示过表达DNMT2显著促进细胞迁移，过表达癌变体后GES-1细胞的迁移几乎都被抑制；划痕愈合结果显示，大部分癌变体都抑制GES-1细胞迁移，只有野生型DNMT2组、E63K和E185D促进细胞的迁移。正常细胞GES-1中，除了E202Q/V和L257I这三个突变体以外的突变体对细胞划痕愈合的影响与DNMT2酶活结果(李华日,2018,未发表数据)一致。
7.DNMT2的多种癌症变体对SGC7901细胞增殖与迁移的影响
结果显示，将野生型DNMT2和15种癌变体转染到SGC7901细胞中，发现细胞计数和MTT结果没有显著性差异；G155S/C/V、E185K、D226Y/H、L257I/V、E317G/D和R371H等癌症变体促进SGC7901细胞迁移，与DNMT2酶活结果相反；使DNMT2酶活性升高的癌症变体如E185D则抑制SGC7901细胞迁移；细胞划痕实验结果显示，G155C/V、D226H、E317G/D使DNMT2的酶活性降低，同时促进SGC7901细胞的迁移；E63K、E202V和L257I使DNMT2的酶活性升高，同时抑制SGC7901细胞的迁移；R371H和D226Y对DNMT2酶活性下调的最显著，过表达R371H和D226Y48h后，SGC7901部分细胞出现死亡。
综合上述研究结果，本研究论文得到的结论如下：
A．DNMT2的H101Y癌症变体在本论文所检测的胃癌患者样品中所占比例达13.04%；H101Y改变细胞中DNMT2蛋白的定位，并导致胃癌组织中淋巴细胞浸润增多，可能与胃癌的转移和预后相关。
B．首次揭示DNMT2-H101Y变体参与胃癌细胞系SGC7901中的信号通路变化，ECM-receptor信号通路的变化影响胃癌细胞的迁移；对ECM-receptor信号通路相关因子的验证发现，DNMT2和H101Y参与胃癌细胞上的ECM受体与细胞外基质的相互作用。揭示了DNMT2和H101Y能够通过调节MMP2、ITGB1和ITGB4的蛋白表达并与ECM相互作用而促进或抑制GES-1细胞的迁移；通过调节MMP9、MMP12和ITGB3的表达影响SGC7901细胞的迁移。
C．其他DNMT2癌变体对GES-1和SGC7901细胞系的生长和迁移有促进或抑制的作用。使DNMT2的酶活降低的变体能促进胃癌细胞的迁移，反之使DNMT2酶活升高的变体则抑制胃癌细胞的迁移。间接证明DNMT2通过参与调节胃癌细胞系的生长和运动来影响癌症细胞的迁移活动。
本论文的研究结果揭示了DNMT2的H101Y变体在胃癌发病过程中的功能机制，为胃癌的早期诊断和干预提供了潜在的新靶点。