研究背景细胞迁移(cell migration)是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。细胞迁移需要内外因素的配合,外部因素如表皮生长因子、白细胞介素1等信号分子；细胞内因素有信号传导系统、细胞骨架和分子马达、参与粘着斑形成的各种分子等。具体过程为细胞外信号分子与细胞膜表面上的受体结合,启动细胞内的信号分子,细胞内的信号分子将运动信息进一步传给细胞迁移的执行单位——细胞骨架和分子马达,进而完成一系列的迁移活动。种类繁多的细胞内信号分子会相互作用,从而影响细胞骨架和分子马达的分布、结构和活性,达到精细调整细胞运动的目的。瞬时受体电位通道(TRP channels)是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道超家族,主要通透钙离子、钠离子等。所有的TRP通道蛋白均具有6次跨膜结构域,形成4聚体(tetramers),于5-6段间形成离子通道小孔,通过细胞的双层脂膜供阳离子进出细胞。最初人们对TRP离子通道的认识仅限于感觉系统,因为该通道通过感受细胞内外环境的各种刺激,参与痛温觉、机械感觉以及味觉的发生和维持细胞内外的离子稳态等众多生命活动。TRPC分子的C末端以TRP框为起点,存在一个保守的25个氨基酸序列区,它与磷脂酰肌醇介导的通道门控位点有关,TRP结构域参与调节TRP通道的功能。TRPC亚家族包括TRPC1-7,共7种亚型。TRPC1在脑、心脏、肾脏、肺、骨骼肌、前列腺、皮肤、睾丸和卵巢都检测到其高水平表达。作为最早被发现的哺乳动物TRP通道,公认的TRPC1的功能是参与受体介导的、钙依赖的平滑肌及腺体的分泌和收缩功能,参与细胞膜受体激活磷脂酶C(PLC)后所介导的钙离子进入。TRPC1通道是一种非选择性阳离子通道,主要通透的离子为钙离子、钠离子。TRPC1通过参与多种信号通路调节细胞的生长及凋亡、树突形成、细胞周期的调节、细胞迁移等。TRPC1可被配体如外源性小分子、化合物、无机离子和内源性物质钙离子浓度变化、PLC、STIM1等激活,也可被受体例如G蛋白偶联受体或受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)介导的PLC信号通路激活,被认为是最可能的钙库操纵性钙通道和受体操纵性钙通道的分子基础。很多研究表明TRPC1与磷脂酰肌醇有相互作用,例如在细胞极性化过程中,TRP蛋白、PIP2和PIP3受P13Kγ和PLC的调节,在细胞膜上这些分子呈现为相互作用。概括来说,PLC调节胞外钙离子进入胞内主要通过和TRPC通道形成分子间的脂质连接区而起作用,这种蛋白-脂质复合物参与TRPC通道在膜上的定位和表面表达的调节。PIP2水解可以影响TRP通道的门控,这种调解的机制可能与TRPC分子的C末端存在磷脂酰肌醇介导的通道门控位点有关。PIP2和PIP3可以介导内皮缩血管肽-1激活兔冠状动脉肌细胞上的TRPC1/5/6。蛋白激酶B(PKB/Akt)参与多个信号通路并扮演着信号通路中关键调节分子的作用,并且调控其下游多种分子,在细胞迁移和侵袭、周期调控、凋亡和增殖、肿瘤血管生成等方面发挥重要作用。PI3K/Akt信号通路是在肿瘤细胞迁移方面比较重要的信号传导通路,有研究表明用抑制剂Wortmannin抑制P13K后对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的大鼠血管平滑肌细胞的迁移有明显影响,主要是影响了磷酸化Akt蛋白的作用。近期有研究表明PI3K/Akt信号通路参与肌细胞的更新和再生,当TRPC1通道被抑制或者抑制Ca2+内流会减少PI3K/Akt信号通路的激活,减慢成肌细胞的迁移并且损害肌细胞的再生。反之由TRPC1介导的Ca2+内流会增强PI3K/Akt信号通路的激活,增强肌细胞的再生能力。PI3K/Akt信号通路是在肿瘤研究方面一条比较重要的信号传导通路,在细胞的凋亡和增殖、肿瘤血管生成、细胞迁移和侵袭、周期调控等方面发挥重要作用。(1)Akt是P13K下游最重要的信号分子,它是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,约由480多个氨基酸序列构成。Akt分子的氨基酸由N末端到C端依次是N端的PH结构域、中间有酶活性的催化结构域和C末端的短的羧基端调节结构域构成。PH结构域介导Akt活化后的质膜转位过程,它含有7条β折叠,反向平行构成β片层一个“疏水区”。中间有酶活性的催化结构域含有ATP结合位点,具有催化丝氨酸、苏氨酸残基的基团,可发生磷酸化而被活化,其中308位点的Thr的磷酸化是Akt活化所必需的；C末端是富含脯氨酸的疏水结构域,可跨膜转运,其中含有Akt完全活化所必需的第2个磷酸化位点,即473位的Ser。(2)在正常细胞和肿瘤细胞中,Akt能被多种物质如表皮生长因子、激素、细胞外基质成分等激活,Akt通过磷酸化和去磷酸化方式调节其下游100多种底物分子,从而调控细胞生长、增殖、凋亡机制。Akt的活化包括两种,P13K依赖型和P13K非依赖型两种。P13K是细胞内的一种磷脂酰肌醇激酶,它可特异性的活化肌醇基团环上的第3位羟基,具有蛋白激酶和类脂激酶双重活性。(3)Akt是PI3K/Akt信号通路的中枢。PI3K/Akt信号通路对多种生命活动的调节均依靠Akt蛋白的磷酸化。Akt的活化需要Akt蛋白多肽链上的Thr308和Ser473同时发生磷酸化。具体过程是：当细胞外因子如表皮生长因子作用于细胞膜上的受体酪氨酸激酶(RTK),受体酪氨酸激酶和配体结合后激活细胞膜上的PI3K, PI3K激活后在质膜上产生第二信使PIP3,PIP3可与细胞内信号蛋白Akt和PDK2等蛋白结合,PIP3与Akt的PH区结合后使无活性的Akt等蛋白从细胞质转位到细胞膜上,同时催化Akt蛋白链上Ser124和Thr450磷酸化获得催化活性。Ser124和Thr450磷酸化后使Akt蛋白的空间结构发生改变,暴露出Thr308和Ser473位点。同时,转位到细胞膜的Akt与PDK1等蛋白进一步相互靠近,PDKl蛋白催化Akt的Thr308位点磷酸化,PDK2蛋白催化Akt的Ser473位点磷酸化。Thr308和Ser473的活化最后导致Akt完全活化。活化的Akt引起下游相关靶蛋白的磷酸化级联反应,导致相应靶蛋白激活或失活,从而调控细胞生长与存活、增殖或凋亡、细胞迁移、血管生成等多种细胞活动和生物学效应。综上所述,TRPC1和Akt可能在细胞迁移中有交互作用,但是对于在细胞迁移过程中TRPC1和Akt是否有相互作用还不太清楚,本研究利用表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)刺激诱导cos-7细胞这一研究细胞迁移的经典模型,通过荧光共振能量转移(FRET)技术探讨细胞迁移过程中TRPC1和Akt的相互作用。目的本实验通过质粒构建将两个目的基因TRPC1和Akt分别重组到荧光表达载体质粒pECFP-C1和pEYFP-C1上,得到pECFP-C1-TRPC1和pEYFP-C1-Akt两个重组质粒；利用细胞免疫荧光技术、重组质粒表达融合荧光蛋白技术以及荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)受体蛋白漂白法等,研究EGF刺激诱导cos-7细胞迁移过程中,TRPC1和Akt是否有相互作用。方法1.利用分子克隆基因重组技术获得目的质粒利用分子克隆基因重组技术,将TRPC1、Akt、和YFP的cDNA分别重组到pECFP-C1、pEYFP-C1、pECFP-C1质粒上,得到pECFP-C1-TRPC1、 pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三个重组质粒。2.COS-7细胞对EGF的趋化现象COS-7细胞对EGF呈现出一种趋化现象,在EGF一侧细胞膜形皱褶。提前将盖玻片一角切去一小块置于六孔板的培养孔内,再将COS-7细胞均匀种植于其上。在六孔板内的盖玻片缺角处加10nM的EGF,使细胞发生EGF的点激活。3. TRPC1蛋白和Akt蛋白在cos-7细胞中的免疫荧光定位4.荧光融合蛋白在cos-7细胞中的表达及定位5.EGF激活cos-7细胞后荧光融合蛋白的转位6.激光共聚焦显微镜检测FRETpECFP-C1-TRPC1使目的基因TRPC1和CFP融合表达,而pEYFP-C1-Akt使Akt和YFP融合表达。检测是否TRPC1和Akt发生了相互作用,就等同于检测CFP和YFP是否发生了FRET。CFP蛋白和YFP蛋白构成一个能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对,当两者相隔1.0-10.0nnm,并且供体的发射光谱和受体的吸收光谱有明显的重叠,同时供体的发射光谱和受体的发射光谱要完全分开,且在供体的激发波长下对受体无激发。当以供体的激发光激发,供体分子由基态越迁到激发态后,由于偶极-偶极相互作用,供体分子激发态能量会以非辐射的形式有效地被传递给受体分子。供体和受体之间发生FRET,将会使供体产生的荧光强度降低,受体发射的荧光强度增强,同时伴随供体荧光寿命缩短和受体荧光寿命延长。发生FRET条件：(1)供体的荧光量子产率较高；(2)供体的发射光谱和受体的吸收光谱能有效重叠(大于30%)；(3)供体和受体之间的距离要在1.0-10.0nnm之间。结果1.成功构建pECFP-C1-TRPC1、pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三种质粒。2.在EGF激活的COS-7细胞中,TRPC1和Akt有共定位现象。3.表达融合荧光蛋白TRPC1后用EGF激活COS-7细胞后,可见TRPC1由胞质转位到胞膜及近膜区。4.表达融合荧光蛋白Akt后用EGF激活COS-7细胞后,Akt未发生变化。5.共表达融合荧光蛋白后并用EGF激活COS-7细胞后,TRPC1和Akt由胞质转位到胞膜及近膜区,并共定位在细胞移动方向的前极。6.共表达融合荧光蛋白,TRPC1和Akt未发生FRET,说明它们之间没有相互作用。7.共表达融合荧光蛋白后并用EGF激活COS-7细胞后,TRPC1和Akt发生了FRET,说明它们之间有相互作用。结论在EGF激活cos-7细胞迁移过程中,TRPC1和Akt发生了FRET,表明TRPC1和Akt之间有相互作用。