目的在建立骨质疏松症脾肾两虚型病证结合动物模型的基础上,基于破骨细胞分化调节通路OPG/RANKL,同时采用与脾虚和骨代谢皆密切相关的VIP/VPAC2作为观察指标,探讨在脾虚、肾虚和脾肾两虚状态下,骨吸收与骨形成的变化情况以及OPG/RANKL和VIP/VPAC2的变化特点；另外通过对比健脾方、补肾方及补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠OPG/RANKL信号传导通路及VIP/VPAC2的影响,部分阐明补肾健脾方治疗骨质疏松症的作用机制,从而为阐明“脾肾相关”的科学内涵提供进一步的实验依据。方法选用健康雌性Wistar大鼠110只,随机分为4组：正常对照组12只,脾虚模型组12只,假手术组12只,卵巢切除组74只。卵巢切除组大鼠行双侧卵巢切除术,术后10周,再将卵巢切除组大鼠随机分为：肾虚模型组、脾肾两虚模型组、己烯雌酚组、健脾组各12只,补肾组及补肾健脾组各13只。肾虚模型组大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,摘除双侧卵巢；假手术组只摘取卵巢周围的小块脂肪组织；脾虚模型组采用200%大黄浓煎液灌胃的方法,连续2周后改为每周2次,再持续3个月；脾肾两虚模型组在切除大鼠双侧卵巢10周后,再采用上述脾虚模型制作方法。己烯雌酚组灌胃给予己烯雌酚,浓度为0.0048mg/ml；健脾组、补肾组及补肾健脾组分别灌胃给予四君子汤、龟鹿二仙汤以及龟鹿二仙汤合四君子汤,每日下午1次,连续6天,休息一天,再连续给药6天,如此给药3个月。正常对照组、假手术组、脾虚模型组、肾虚模型组、脾肾两虚模型组按同法灌服等体积的纯净水。每周称重一次,据此调整给药量。各组大鼠在处死前16天和前3天分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重,以对骨进行荧光标记。给药结束后,采用大鼠麻醉后股动脉取血法,血液离心后用于酶联免疫吸附法(ELISA)检测；取血后将各组大鼠处死,取左侧股骨,用于骨密度检测；取右侧胫骨近端1/3,制作不脱钙骨切片,进行骨组织形态计量学指标的检测；取左侧胫骨近端1/3,制作大鼠胫骨脱钙骨的冰冻切片,用作免疫组化法和原位杂交法对骨髓腔中成骨细胞和骨髓基质细胞中VPAC2、OPG和RANKL蛋白和mRNA表达的检测；取结肠组织,制作石蜡切片,用作免疫组化法和原位杂交法对结肠组织中VIP蛋白和mRNA表达的检测。实验结果皆以均数±标准差(x±s)表示,正态分布且方差齐性的数据,采用单因素方差分析,组间两两比较,LSD检验；方差不齐的则采用其项下的Dunnett’s T3检验。非正态分布数据采用非参数检验。结果1补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠股骨βMD的影响表1显示,与假手术组相比,肾虚及脾肾两虚模型组大鼠股骨BMD显著降低,且脾肾两虚模型组BMD降低较之肾虚组更为明显。脾虚模型组大鼠股骨BMD与假手术组无明显差异。与脾肾两虚模型组相比,健脾组、补肾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠股骨BMD均显著增高,但仍显著低于假手术组。与健脾组相比,补肾组及补肾健脾组的BMD均明显增高,且两者之间无差异。注：与假手术组比较：*P<0.05,**P<0.01；与脾虚模型组比较：◇P<0.05,◇◇P<0.01；与肾虚模型组比较：▲P<0.05,▲▲P<0.01;与脾肾两虚模型组比较：△P<0.05,△AP<0.01；与健脾组比较：☆P<0.05,☆☆P<0.01；与补肾组比较：P<0.05,P<0.01。(下同)2补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响2.1补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨TBV%的影响表2显示,脾虚模型组大鼠胫骨TBV%与假手术组相比无明显差异。肾虚及脾肾两虚模型组TBV%显著低于假手术组及脾虚模型组,且与肾虚模型组相比,脾肾两虚模型组TBV%降低更为明显。从各治疗组TBV%结果来看,补肾组、健脾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨TBV%均显著高于脾肾两虚模型组,但明显低于假手术组。与健脾组相比,补肾组及补肾健脾组的TBV%明显增高,且补肾健脾组TBV%增高较补肾组更为明显。2.2补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨TRS%和TFS%的影响表3显示,与假手术组相比,肾虚及脾肾两虚模型组大鼠胫骨TRS%和TFS%均显著增高,而脾虚模型组无明显差异。与肾虚模型组相比,脾肾两虚模型组大鼠胫骨TRS%和TFS%增高更为明显。从各治疗组TRS%和TFS%结果来看,补肾组、健脾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨TRS%和TFS%均显著低于脾肾两虚模型组,且补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨TRS%和TFS%相较于假手术组无明显差异,但补肾组、健脾组大鼠胫骨TRS%和TFS%仍明显高于假手术组。与健脾组相比,补肾组及补肾健脾组的TRS%和TFS%明显降低,且补肾健脾组较补肾组降低更为显著。2.3补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠胫骨OSW、MAR和mAR的影响表4显示,肾虚及脾肾两虚模型组大鼠胫骨OSW、MAR和mAR较之假手术组均显著增高,而脾虚模型组无明显差异。与肾虚模型组相比,脾肾两虚模型组大鼠胫骨MAR和mAR增高更为显著,但OSW无明显差异。与脾肾两虚模型组相比,补肾组、健脾组、补肾健脾组、己烯雌酚组大鼠胫骨OSW、MAR和mAR均显著降低。与健脾组及补肾组相比,补肾健脾组的MAR和mAR均明显降低,但OSW无明显差异。3补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠外周血血清中OPG、RANKL、VIP、MTL、GAS含量的影响3.1补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠外周血血清中OPG及RANKL含量的影响表5显示,脾虚模型组大鼠外周血血清中OPG含量与假手术组无明显差异。肾虚、脾肾两虚模型组OPG含量较之假手术组及脾虚模型组均显著降低,且与肾虚模型组相比,脾肾两虚模型组OPG含量降低更为显著。与脾肾两虚模型组相比,健脾组OPG含量无明显差异；而己烯雌酚组、补肾组、补肾健脾组OPG含量均显著增高,但仍显著低于假手术组。与健脾组相比,补肾组和补肾健脾组OPG含量均明显增高,且补肾健脾组明显高于补肾组。与假手术组相比,脾虚、肾虚、脾肾两虚模型组大鼠外周血血清中RANKL含量均显著增高,且肾虚组RANKL含量明显高于脾虚组,脾肾两虚组又明显高于肾虚组。与脾肾两虚模型组相比,己烯雌酚组、健脾组、补肾组、补肾健脾组RANKL含量均显著降低,但较之假手术组仍显著增高。与健脾组相比,补肾组和补肾健脾组RANKL含量均显著降低,且补肾健脾组明显低于补肾组。3.2补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠外周血血清中VIP含量的影响表6显示,与假手术组相比,脾虚、肾虚、脾肾两虚模型组大鼠外周血血清中VIP含量均显著增高,且脾虚组VIP含量明显高于肾虚组,脾肾两虚组又显著高于脾虚组。从各治疗组VIP含量来看,除己烯雌酚组外,健脾组、补肾组、补肾健脾组VIP含量均显著低于脾肾两虚模型组；但健脾组和补肾组仍明显高于假手术组,而补肾健脾组与假手术组无差异。与补肾组相比,健脾组和补肾健脾组VIP含量明显降低,且两者之间无差异。3.3补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠外周血血清中MTL、GAS含量的影响表7显示,脾虚、肾虚、脾肾两虚模型组大鼠外周血血清中MTL含量较之假手术组均显著降低,脾肾两虚模型组又显著低于脾虚和肾虚组。与脾肾两虚模型组相比,健脾组和补肾健脾组MTL含量均显著增高,且两者之间无差异；但己烯雌酚组和补肾组无明显变化。健脾组和补肾健脾组MTL含量均显著高于补肾组。与假手术组相比,脾虚、肾虚、脾肾两虚模型组大鼠外周血血清中GAS含量均显著降低,且脾虚组GAS含量明显低于肾虚组,脾肾两虚组又明显低于脾虚组。与脾肾两虚模型组相比,健脾组和补肾健脾组GAS含量均显著增高,但己烯雌酚组和补肾组无明显差异。补肾健脾组GAS含量明显高于健脾组和补肾组。4补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠OB及MSC中OPG>RANKL及VPAC2蛋白和mRNA表达的影响4.1补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠OB及MSC OPG蛋白和mRNA表达的影响表8显示,与假手术组相比,脾虚模型组大鼠OB及MSC的OPG蛋白和mRNA表达阳性密度与之无差异,而肾虚、脾肾两虚组的OPG阳性密度明显降低,且脾肾两虚组又明显低于肾虚组。与脾肾两虚模型组相比,己烯雌酚组、健脾组、补肾组、补肾健脾组OPG蛋白和mRNA表达阳性密度均明显增高,但较之假手术组仍明显降低。与健脾组相比,补肾组和补肾健脾组OPG蛋白和mRNA表达阳性密度明显增高,且两者之间无明显差异。4.2补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠OB及MSC RANKL蛋白和mRNA表达的影响表9显示,与假手术组相比,脾虚、肾虚、脾肾两虚模型组大鼠OB及MSCRANKL蛋白和mRNA表达的阳性密度均明显增高,且肾虚组阳性密度明显高于脾虚组,脾肾两虚组又明显高于肾虚组。与脾肾两虚模型组相比,己烯雌酚组、健脾组、补肾组、补肾健脾组RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度均明显降低,但仍明显高于假手术组。与健脾组相比,补肾组和补肾健脾组RANKL蛋白和mRNA表达阳性密度均明显降低,且两者之间RANKL蛋白表达无差异,但补肾健脾组RANKL mRNA表达阳性密度降低更为明显。4.3补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠OB及MSCVPAC2蛋白和mRNA表达的影响表10显示,与假手术组相比,脾虚、肾虚、脾肾两虚模型组大鼠OB及MSC中VPAC2蛋白和mRNA表达的阳性密度均明显增高。与肾虚组相比,脾虚、脾肾两虚组VPAC2阳性密度的增高更为明显,且两者之间无差异。与脾肾两虚模型组相比,己烯雌酚组VPAC2蛋白和mRNA表达阳性密度无差异,健脾组、补肾组、补肾健脾组均明显降低。与补肾组相比,健脾组和补肾健脾组VPAC2蛋白和mRNA表达阳性密度明显降低,且两者之间无差异。5补肾健脾方对脾肾两虚型骨质疏松大鼠结肠组织中VIP蛋白和mRNA表达的影响表11显示,与假手术组相比,肾虚模型组大鼠结肠组织中VIP蛋白和mRNA表达阳性密度与之无差异,脾虚、脾肾两虚组的VIP阳性密度显著增高,且脾肾两虚组又明显高于脾虚组。与脾肾两虚模型组相比,健脾组、补肾组、补肾健脾组VIP蛋白和mRNA表达阳性密度均显著降低,但仍显著高于假手术组。与补肾组相比,补肾健脾组VIP蛋白和mRNA表达阳性密度均明显降低,健脾组与之无差异。结论(1)去卵巢能够造成大鼠肾虚型骨质疏松症,而单纯给予大黄浓煎剂可造成大鼠脾虚,但不能导致骨质疏松症。将两种方法相结合,可造成大鼠脾肾两虚型骨质疏松症,且发病程度较单纯去卵巢明显加重。说明脾、肾两脏在骨质疏松症发病过程中均有重要作用,其中肾虚是根本,脾虚是其重要影响因素之一。(2)健脾方、补肾方和补肾健脾方对脾肾两虚型大鼠骨质疏松症均具有治疗作用,其中,补肾健脾方的疗效明显优于补肾方和健脾方,而补肾方又优于健脾方。(3)健脾方、补肾方和补肾健脾方共同的作用途径是：一方面,直接调控破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL的表达,使OPG表达上调,而使RANKL表达下调,从而明显降低破骨细胞的活性；另一方面,下调VIP和VPAC2表达,导致VIP与VPAC2结合减少,这可能通过成骨细胞的介导作用,上调OPG水平、并下调RANKL水平,最终使破骨细胞的活性降低,骨吸收减少。此外,还能明显提高外周血中MTL及GAS水平。但三者的调节作用存在差异：健脾方对MTL、GAS、VIP及VPAC2的调节作用较强；补肾方对上述指标的调节作用弱于健脾方,但对OPG、RANKL的调节作用较健脾方显著；而补肾健脾方对上述指标的调节作用均明显强于以上两方。这是补肾健脾方疗效优于补肾方和健脾方的机制之一,也进一步说明在骨质疏松症的发生和治疗过程中,中医的脾肾两脏是密切相关的。