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目的:探讨Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)在肺恶性肿瘤干细胞样细胞(Lung cancer stem-like cells,LCSLCs)中干性维持,及YAP与人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)之间的关联。比较良恶性胸腔积液中YAP及端粒酶的表达差异,以期对肺恶性肿瘤干细胞样细胞干性调控及良恶性胸腔积液的诊疗提供新方法。方法:(一)细胞实验1、用无血清的培养基(Serum free medium,SFM)诱导人肺腺癌A549细胞形成A549细胞球,并用q RT-PCR检测肿瘤干细胞标记物(Ep CAM、CD44、CD133、OCT4、SOX2)的表达。2、用YAP质粒转染A549细胞及A549细胞球,上调A549细胞及A549细胞球YAP蛋白及m RNA的表达。3、用YAP抑制剂维替泊芬(verteporfin,VP)处理A549细胞及A549细胞球。4、通过Western blot检测A549细胞、A549细胞球在YAP WT转染及加入VP后YAP蛋白的表达。5、通过q RT-PCR检测A549细胞、A549细胞球在YAP WT转染及加入VP后YAP、h TERT m RNA的表达。6、用CCK8检测A549细胞、A549细胞球在YAP WT转染及加入VP后的增殖情况。(二)临床研究1、收集25例经病理证实为肺恶性肿瘤患者的胸腔积液细胞,同时收集7例确诊为良性疾病患者的胸腔积液细胞做对照。2、通过q RT-PCR检测良恶性胸腔积液细胞YAP、h TERT、干细胞标记物(Ep CAM、CD44、CD133、OCT4、SOX2)的表达情况,比较其在良恶性胸腔积液的差异及其与恶性肿瘤远处转移的关联。3、通过PCR-ELISA检测良恶性胸腔积液细胞端粒酶活性。结果:(一)细胞实验1、q RT-PCR检测到肿瘤干细胞标记物(CD44、CD133、OCT4、SOX2)的表达在A549细胞球中高于A549细胞,差异具有统计学意义(p<0.05),而Ep CAM在两者之间的差异不具有统计学意义(p>0.05)。2、Western Blot、q RT-PCR检测到YAP蛋白及m RNA的表达在A549细胞球中均高于A549细胞,其差异有统计学意义(p<0.05)。3、Western Blot、q RT-PCR显示用YAP WT转染A549细胞和A549细胞球后,其YAP蛋白及m RNA表达均上调,差异有统计学意义(p<0.05)。4、Western Blot显示在A549细胞和A549细胞球中加入VP后,其YAP蛋白表达均降低,差异有统计学意义(p<0.05),但在q RT-PCR中,A549细胞和A549细胞球的YAP m RNA未见明显下降,其差异无统计学意义(p>0.05)。5、q RT-PCR显示h TERT m RNA在A549细胞球中高于A549细胞,其差异有统计学意义(p<0.05);用YAP WT转染A549细胞和A549细胞球后,h TERT m RNA的表达在A549细胞中升高,差异具有统计学意义(p<0.05),但在A549细胞球中差异无统计学意义(p>0.05);在A549细胞和A549细胞球加入VP后,其h TERT m RNA表达均未见明显改变,差异无统计学意义(p>0.05)。6、CCK8检测到A549细胞球的增殖能力高于A549细胞,差异有统计学意义(P<0.05);YAP WT转染A549细胞和A549细胞球后,A549细胞增殖能力升高,差异具有统计学意义(P<0.05),但A549细胞球的增殖能力无明显改变(p>0.05);加入VP后,A549细胞和A549细胞球的增殖能力均降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。(二)临床研究1、q RT-PCR检测到肺恶性肿瘤胸腔积液细胞YAP、h TERT、干细胞标记物(CD44、CD133、OCT4、SOX2)表达均高于良性胸腔积液细胞,差异具有统计学意义(p<0.05),而Ep CAM在良恶性胸腔积液细胞中的差异不具有统计学意义(p>0.05)。2、YAP、h TERT、CD133的表达在发生远处转移的肺恶性肿瘤胸腔积液细胞中的表达较未发生远处转移的肺恶性肿瘤胸腔积液细胞更高(p<0.05),而CD44、OCT4、SOX2在肺恶性肿瘤有无发生远处转移中的表达差异不具有统计学意义(p>0.05)。3、PCR-ELISA检测表明在肺恶性肿瘤胸腔积液细胞中端粒酶的活性高于良性,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1、在A549细胞诱导而来的A549细胞球及胸腔积液细胞中,YAP与h TERT m RNA的表达成正相关,均参与了肿瘤干细胞样细胞特性的维持。2、较高的YAP、h TERT m RNA的表达与肺恶性肿瘤发生远处转移有关。3、胸腔积液细胞中YAP、h TERT、肿瘤干细胞标记物(CD44、CD133、OCT4、SOX2)的表达对良恶性胸腔积液的鉴别有一定的价值。