【背景】膀胱癌是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤,临床上,近半数膀胱癌患者在确诊时已处于中晚期,即肿瘤已发生浸润和转移,临床治疗效果很差。膀胱癌根据不同病理分期,可分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)以及肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),NMIBC以经尿道膀胱肿瘤电切术为主,而MIBC则为全膀胱根治性切除加淋巴结清扫术。然而,膀胱癌患者术后预后差异极大,大约60%的NMIBC患者行经尿道膀胱肿瘤电切术后会复发,而MIBC患者行全膀胱根治性切除术后仍有约50%患者发生局部复发或远处转移。因此,对于膀胱癌发生及进展密切相关基因的分子机制及其临床肿瘤学意义的深入研究,有助于探索膀胱癌分子分型,实现膀胱癌个体化治疗。最新高通量测序手段、生物信息学分析等手段为深入研究膀胱肿瘤的发病机制提供良好的平台,可以有效分析肿瘤发生发展相关的信号通路和关键靶点,为肿瘤早期诊断、个体化治疗提供可行的依据。目前对于国人的膀胱癌全基因组测序相关研究尚缺乏,为此我科室膀胱癌课题研究组自2011年即开始联合深圳华大基因研究院,运用第二代基因测序手段对膀胱癌发病机制进行了深入研究,探索膀胱癌发生及发展机制及寻找分子分型标记物。【目的】通过第二代基因测序探索膀胱癌与配对正常尿路上皮差异表达分子,寻找与膀胱癌发生及进展密切相关的基因,探索其在膀胱癌分子分型中的作用及其在膀胱癌中的生物学功能。【材料与方法】1.提取10例行膀胱癌根治术患者膀胱癌组织及其配对的癌旁正常尿路上皮行转录组二代基因测序。通过生物信息学分析结合文献报道,筛选出候选基因行进一步验证及功能探讨。2.抽提40对膀胱癌组织及配对正常尿路上皮组织RNA行q RT-PCR,检验ANLN基因m RNA表达量,达并探索ANLN基因与膀胱癌分级、分期的关系。3.通过公共测序信息数据库GEO(Gene Expression Omnibus)及TCGA(The Cancer Genome Atlas,TCGA)行数据挖掘,验证其中ANLN基因表达量与膀胱癌病理分期及预后关系。4.对209例膀胱癌患者的肿瘤组织石蜡切片行免疫组化染色方法,探讨ANLN编码蛋白Anillin的表达量,比较Anillin在膀胱肿瘤组织及正常尿路上皮中表达量差异。探讨Anillin表达量与膀胱癌病理分级、分期关系及其与患者预后关系。5.通过q RT-PCR检测7种膀胱癌细胞系ANLN基因m RNA表达量。采用瞬转干扰RNA(si RNA)方法对ANLN基因高表达细胞系J82及5637行基因敲减,通过CCK-8实验检测ANLN基因敲减对J82及5637细胞增殖能力影响。通过构建慢病毒实现对J82细胞系ANLN基因的稳定敲减。利用慢病毒稳转J82细胞建立膀胱癌裸鼠皮下成瘤及原位膀胱肿瘤模型,通过在体动物实验验证ANLN基因与膀胱癌细胞增殖能力关系。6.通过细胞划痕及Transwell小室细胞侵袭实验探索ANLN基因敲减对膀胱癌细胞J82及5637迁移、侵袭能力的影响。7.通过流式细胞术检测探索ANLN基因敲减对膀胱癌细胞J82及5637细胞周期及凋亡影响。8.通过免疫荧光染色及细胞苏木素伊红染色探索ANLN基因敲减对J82细胞有丝分裂及细胞形态影响。9.通过基因芯片分析J82细胞ANLN敲减组与对照组差异表达基因,探索ANLN基因参与膀胱癌发生及发展的机制及其与其他信号通路、基因的相互作用。【结果】1.10例膀胱癌组织及其配对癌旁正常尿路上皮转录组测序发现大量差异表达信号分子,本研究采用以下条件对差异表达基因进行筛选:(1)差异表达倍数log2-fold change≧2;(2)每对样本测序RPKM值≧10;(3)候选基因在10对测序样本中至少8对表达趋势一致;(4)候选基因在膀胱癌组织与配对正常尿路上皮差异表达具有统计学意义,即probability≧0.8(相当于p值<0.01);(5)候选基因在已有膀胱癌研究文献中无报道。通过上述条件筛选,ANLN基因符合以上所有要求,其log2-fold change倍数为2.926;ANLN差异表达probability为0.835;ANLN在每对样本中测序RPKM值均≧10;测序10对样本中,ANLN在9对膀胱癌组织中表达量显著高于配对正常尿路上皮;尚无研究报道ANLN基因在膀胱癌中有相关作用。2.选取40例患者膀胱癌组织及其配对正常尿路上皮组织行q RT-PCR实验检测ANLN基因表达量,40例患者中36例膀胱癌组织ANLN表达量显著高于配对正常尿路上皮。将40例验证标本按照不同病理分期及分级分类,分别分析ANLN基因表达量。ANLN基因在肌层浸润性膀胱癌表达量明显高于非肌层浸润性膀胱癌,而ANLN基因表达量在高级别与低级别膀胱癌之间无明显差异。3.209例膀胱癌组织石蜡切片ANLN免疫组化染色分析发现肌层浸润性膀胱癌ANLN表达量显著高于非肌层浸润性膀胱癌(p<0.01),高级别膀胱癌中ANLN表达量显著高于低级别膀胱癌(p<0.01)。患者平均随访27.9月,高表达ANLN膀胱癌患者肿瘤特异生存时间(中位生存时间为22.4月)明显低于ANLN低表达患者(中位生存时间为37.3月,p=0.001);ANLN高表达患者肿瘤无进展生存时间(中位时间为19.7月)显著低于ANLN低表达患者(中位时间为27.9月,p=0.001);ANLN高表达患者肿瘤无复发生存时间(中位时间为17.1月)显著低于ANLN低表达膀胱癌患者(中位时间为25.2月,p=0.011)。4.公共测序数据库NCBI-GEO数据分析进一步证实ANLN基因在肌层浸润性膀胱癌中表达量显著高于非肌层浸润性膀胱癌(p<0.01)。TCGA数据库分析则证实ANLN基因高表达患者肿瘤特异生存时间(中位生存时间14.75月)明显低于ANLN基因低表达患者(中位生存时间36.86月,p=0.007)。5.CCK-8细胞增殖实验显示,与阴性对照组相比,si RNA干扰ANLN基因表达导致膀胱癌细胞J82与5637增殖能力显著减弱。裸鼠皮下成瘤膀胱癌模型及原位膀胱肿瘤模型进一步证实ANLN基因敲减导致膀胱癌细胞增殖能力减弱。6.划痕实验中,敲减ANLN基因后J82细胞与5637细胞的迁移能力较阴性对照组显著下降。在Transwell细胞侵袭实验中,敲减ANLN基因可以显著抑制J82和5637细胞的侵袭能力。7.与阴性对照组相比,敲减ANLN基因导致J82及5637细胞出现G2期阻滞,而敲减ANLN基因对于J82与5637细胞凋亡则无明显影响。Western-blot实验证实ANLN基因敲减可导致J82与5637细胞中Cyclin B1与Cyclin D1蛋白表达降低。免疫荧光实验显示ANLN蛋白参与有丝分裂过程中分裂沟形成。而细胞苏木素伊红染色则提示ANLN基因敲减导致膀胱癌细胞有丝分裂障碍,多核膀胱癌细胞数量较对照组显著增加。8.通过对ANLN基因敲减组与阴性对照组基因表达芯片分析,ANLN敲减引起的差异表达基因GO分析结果显示其功能主要与细胞移动、迁移能力有关。而差异表达基因KEGG信号通路分析则提示ANLN基因参与膀胱癌发生及进展的过程与Jak-STAT信号通路,Toll-like信号通路,PI3K/AKT信号通路,TNF信号通路有关。【结论】ANLN基因及其编码的蛋白在膀胱癌组织中高表达,且其表达水平与膀胱癌的病理分级与分期相关,ANLN高表达是膀胱癌患者不良预后的独立危险因子。ANLN基因与膀胱癌进展密切相关,干扰ANLN基因表达可显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。ANLN基因通过调控膀胱癌细胞有丝分裂及细胞周期参与调控膀胱癌细胞生物学功能,并与肿瘤发生及进展密切相关的PI3K/AKT,TNF等信号通路相互作用。