南极具有独特的地理环境及气候特征，其主要特点是：变化极大的光照辐射、季节性的光照时间；常年极低的水温(通常在-1.8℃～2.0℃)，在冬季最低气温可以达到-50℃；高盐度环境(海水中的盐度一般为34‰～35‰)，海冰中的盐囊和盐通道的盐度可达到150‰。酷寒、低光照、强辐射以及高盐度的自然环境造就了南极微生物特殊的生物学特征。因此，南极微生物不仅是研究低温生物低温适应性的极好材料，而且也是获得在低温条件下具有较大催化能力的适冷酶类的最佳来源。对南极微生物及其产生的适冷酶进行研究，有着重要的生物学意义；同时，由于在低温下能够发挥高效的催化作用，适冷酶在生物工程领域有着广阔的应用前景。本研究以筛选到的南极适冷菌Bacillus cereus NJ655为研究对象，对该菌株分泌的胞外适冷淀粉酶进行了较系统的研究，同时对该菌株的脂肪酸组成变化与各种环境的适应性也予以初步探讨，以期为南极微生物的深入研究和开发应用提供科学依据。 (1)采用水解淀粉平板方法对本试验室保藏的260株南极低温菌产适冷淀粉酶活性进行了测定，筛选到51株产淀粉酶活性的菌株，其中3株菌(NJ655，NJ5-7，NJ345；10℃)所产的淀粉酶活性高于100 U/mL。对3株菌所产淀粉酶的部分酶学特性进行了初步的研究，发现淀粉酶的酶学性质及酶的种类和数量存在一定差异。其中；菌株NJ345、NJ5-7所产的淀粉酶的最适反应温度在40℃左右，而菌株NJ655所产淀粉酶的最适反应温度在35℃左右。随后，对产淀粉酶活性最高的株菌NJ655进行了16S rRNA分子鉴定，确定该菌株属于厚壁菌门(Firmicutes)，芽孢杆菌纲(Bacilli)，芽孢杆菌目(Bacillales)，芽孢杆菌科(Bacillaceae)，芽孢杆菌属(Bacillus)，蜡状芽孢杆菌(cereus)；将其命名为Bacillus cereus NJ655。 (2)以国内外研究较少且仅分泌一种适冷淀粉酶的南极适冷菌Bacilluscereus NJ655为研究材料，进行产淀粉酶优化培养的结果表明，菌株B .cereusNJ655发酵培养基的初始pH值最适值为pH7～9；接种量最适值为4％～10％；通气量最适范围为60～100mL/250mL，转速100r/min；3.0％～4.5％的盐度对菌体的生长和产酶最有利；淀粉和豆粕分别为产酶培养基中的最佳碳源和氮源；Ca<2+>和吐温-80也有利于产酶。在单因素试验基础上，采用响应面分析法(RSM)应用到低温发酵培养中，模拟出该菌株产淀粉酶的二次多元回归模型，确定了最优的发酵条件为：培养基中，陈海水1000mL，KH<,2>PO<,4>lg，MgSO<,4>·7H<,2>O 0.2g，可溶性淀粉，6.7g/l；豆粕，5.1 g/1.通气量，76mL/250mL，(转速100r/min)；吐温-80，0.29g/l；初始pH7.5；温度，20℃；100r/min，振荡培养96h。优化后培养基的淀粉酶实际产量为345.61U/mL(与模型预测产量350.92U/mL基本吻合)，为初筛选时酶活的2.3倍；而且菌株传代产酶稳定性较好。 (3)通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析四个主要分离步骤后，酶的总纯化倍数达21.8倍，总回收率为10.5％，酶比活力由8.1 U/mg提高到176.2U/mg；考马斯亮兰染色、银染和酶谱电泳鉴定均为单一带，表明该淀粉酶达到了均一性。进一步通过HPLC对纯化后淀粉酶样品纯度进行鉴定，呈单一主峰，纯度为92.6％，达到色谱纯纯度。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测得该淀粉酶的分子量为44.7kDa。 (4)在获得较高酶纯度的基础上，对该适冷淀粉酶的性质进行了研究。该酶的最适温度为35℃；对高温具有不稳定性，经50℃处理40min或60℃处理10min能基本灭活；低温-78℃和-20℃是该酶最佳的保藏条件。该淀粉酶在pH5～12时均有活力，且酶活力稳定，pH8.5时酶活力最高。金属螯合剂EDTA和EGTA对淀粉酶活力的抑制率分别为66.8％和71.4％；Thiourea、DTT、Urea、SDS、Triton X-100等均能不同程度地抑制酶活力。该淀粉酶能被金属离子Ca<2+>激活；Na<+>、Zn<2+>、Mn<2+>、pb<2+>、Al<2+>对酶活力有不同程度的抑制，而Fe<2+>、Fe<3+>和Cu<2+>对淀粉酶的抑制率高达100％。该淀粉酶的K<,m>值为2.4g/L，活化能为23.9kJ/mol。对该淀粉酶的酶解产物分析结果显示，淀粉最终主要被水解生成麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖，该酶为内切酶。 (5)低温因素使B.cereus NJ655长链脂肪酸或不饱和脂肪酸含量的增加，这有益于其在低温环境下保持细胞质膜功能，是南极微生物对南极极端环境的一种适应。高盐因素使该菌短链的脂肪酸增多，脂肪酸种类减少；总的饱和脂肪酸含量明显升高，支链脂肪酸含量占菌株总脂肪酸含量的60％以上。试验结果表明：高盐胁迫使该菌株的C20：0含量骤增；而这个过程则很可能是菌株为适应突然的高盐环境，先将不饱和脂肪酸C20：1转变为相同链长的饱和脂肪酸C20：0，然后再代谢为其它的短链或支链的脂肪酸。成冰因素对该菌脂肪酸组成和含量变化较小。这说明，在海冰环境中低温和高盐的双因子共同作用可以减弱其单因子的作用。 综上所述，本研究从260株南极低温微生物中筛选到1株产适冷淀粉酶活力较高的菌株NJ655，并对其进行16S rRNA分子鉴定，构建了系统发育树。以该菌株为研究材料，利用响应面分析法优化了产淀粉酶的发酵条件，在获得纯度较高淀粉酶的基础上，较系统地研究了该酶的酶学性质。首次报道了南极适冷菌株Bacillus cereus分泌适冷淀粉酶，为适冷淀粉酶的理论研究和应用开发提供了数据材料。南极微生物作为研究微生物适应极端环境的最好资源，本研究采用低温、高盐、成冰等因素对B．cereus NJ655脂肪酸组成及含量的影响，首次揭示了该菌在高盐胁迫条件下长链不饱和脂肪酸C20：1的代谢途径，为了解南极适冷细菌对南极地区极端环境的适应机制提供了科学依据。