水中病原体FCM-qPCR检测方法的建立及其应用研究

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饮用水污染是导致肠道疾病的主要原因,肠道疾病的发生主要是由水中的病原体所导致。在水样传统检测方法中,以粪源菌检测为主,而忽视其他原虫、病毒类病原体的检测。这种单纯检测某一种属病原体的方式,使得病原体检测范围很有限,且检测结果不具有代表性。为克服之前检测方法中存在的不足,选择腺病毒、军团菌、大肠杆菌、贾第虫和隐孢子虫等典型病原体作为研究对象,即分别以病毒、细菌和原虫三类病原体作为研究对象,使得检测范围相对更加广泛、更加具有代表性。以流式细胞术和定量PCR技术作为基本检测技术,提出了针对细菌、病毒和原虫三类病原体中几种典型病原体检测的方法,以更好的评价水中的病原体污染水平。然后,将建立的FCM-q PCR检测方法应用到六座污水处理厂进出水和受纳河道中水样的检测中。通过研究得到以下结论:(1)通过优化预处理手段和调节稀释比,确定水样不过滤和相对较高的稀释比时,有助于细菌和病毒的计数;在25℃和80℃条件下进行染色对比,确定80℃染色不利于细菌计数。在所得结论的基础上,建立FCM检测水中细菌和病毒的方法。(2)通过对退火温度做温度梯度,优化大肠杆菌、细菌、军团菌、腺病毒、贾第虫和隐孢子虫基因片段的PCR扩增条件,确定几种基因片段的最优退火温度分别为58℃、61℃、60℃、55℃、58℃和63℃。根据优化结果,建立定量PCR检测水中几种典型病原体的检测方法。(3)FCM-q PCR检测方法对水中病原体的检测具有较高的特异性、较高的准确性以及较低的检测限。(4)将建立的FCM-q PCR检测方法应用到污水处理厂的进、出水以及对应的受纳河道上和下游水样的病原体检测中。分析发现:不同水样之间,同种病原体浓度水平有较大的差异;相同水样,不同病原体之间存在较大的浓度差异;不同污水处理厂进水和不同污水处理厂受纳河流水样,其细菌浓度和病毒浓度变化范围均相对较小。
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