目的:研究食管鳞癌细胞中BNIP3的表达与缺氧及其启动子区甲基化程度之间的关系,以及缺氧情况下BNIP3表达对细胞凋亡与自噬的影响,探讨缺氧条件下BNIP3表达激活对食管鳞癌细胞生存的影响。方法:1、通过Western blot及MSP法验证不同食管鳞癌细胞系BNIP3表达与其启动子区甲基化状态,筛选BNIP3高甲基化且表达较低细胞系(KYSE140)及BNIP3低甲基化且高表达细胞系(CAES17),并通过Western blot检测缺氧对不同甲基化状态的BNIP3表达的影响。2、使用胎盘蓝染色及MTT法检测不同缺氧时间情况下CAES17在BNIP3干扰前后的死亡及增殖情况;使用5-Aza-Cd R去除KYSE140 BNIP3高甲基化状态后,再次用上述方法检测;通过使用自噬抑制剂3-MA阻断自噬过程后再次检测细胞死亡情况。3、使用MDC染色法(单丹磺酰戊二胺染色法)及GFP-LC3荧光转染法检测缺氧情况下CAES17中BNIP3表达对细胞自噬的影响;使用5-Aza-Cd R去除KYSE140 BNIP3高甲基化状态后,再次用上述方法检测。4、使用Caspase-3活性检测法及Annexin V-FITC/7-AAD双染法检测缺氧情况下CAES17中BNIP3表达对细胞凋亡的影响;使用5-Aza-Cd R去除KYSE140 BNIP3高甲基化状态后,再次用上述方法检测。结果:1、4种食管鳞癌细胞系中,KE4及CAES17中BNIP3相对高表达且其启动子区甲基化状态较低,而KYSE140及TE7中BNIP3相对低表达且其启动子区甲基化状态较高。2、缺氧可以诱导CAES17细胞系BNIP3表达升高,且呈现随着缺氧时间延长,表达逐渐增加趋势。3、缺氧不能诱导KYSE140细胞系BNIP3的表达,5-Aza-Cd R处理后可以恢复缺氧诱导BNIP3表达。4、缺氧可以诱导CAES17死亡率增加及细胞活力下降,呈缺氧时间依赖性。靶向干扰BNIP3表达后,细胞死亡率在缺氧的3个时间段均下降,细胞活力增加,差异有统计学意义(p<0.05)。缺氧对KYSE140死亡率无明显影响,但当使用5-Aza-Cd R(1μM)去除甲基化之后,两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。5、经胎盼兰染色法和MTT法检测表明,缺氧条件下3-MA处理组较未处理组可显著增加细胞死亡率,降低细胞活力。且细胞凋亡检测实验表明,3-MA处理后能增加细胞凋亡率。6、缺氧可以诱导CAES17自噬率(含LC3-GFP小体的阳性细胞)升高,可由常氧时的16.7%升高至46.3%(P<0.05)。干扰BNIP3后自噬率降至29.2%(P<0.01)。在KYSE140细胞中,经5-Aza-Cd R处理后显示同样的趋势。7、缺氧诱导CAES17细胞系细胞凋亡率增加,由3.1%升高至15.6%。干扰BNIP3表达可以降低细胞凋亡率至11.3%(P<0.01)。在KYSE140中,无论是否缺氧处理,去除甲基化之后,细胞凋亡率均可增加。缺氧时,干扰BNIP3表达细胞凋亡率为可由14.6%降至10.3%(p<0.05)。8、缺氧情况下,干扰CAES17细胞系BNIP3表达前后,Caspase-3活性之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1、食管鳞癌细胞中,BNIP3表达受其启动子区甲基化状态调控,启动子区高甲基化状态可抑制BNIP3表达。2、缺氧可以诱导BNIP3表达上调,一定范围内呈缺氧时间依赖性,但受BNIP3启动子区甲基化状态调控。3、食管鳞癌细胞中,缺氧诱导的BNIP3表达上调可以诱导保护性自噬产生。4、食管鳞癌细胞中,缺氧诱导的BNIP3表达上调可以诱导非Caspase依赖性的凋亡并导致最终细胞死亡,即使BNIP3可以诱导保护性自噬产生。