论文部分内容阅读
马铃薯在生长期中受各种辆毒病的为害而造成质量和品质的下降。通过植物抗病毒基因工程进行作物育种是防治病毒病害最经济有效的方法。在抗病毒基因工程所应用的转基因中，利用病毒外壳蛋白基因为转基因是较为成熟的抗病毒育种策略。在对转病毒外壳蛋白基因植株进行抗病性鉴定时发现，转病毒外壳蛋白基因的转基因植物的抗病机制是RNA介导的，其中RNA介导的植物抗病毒策略由于具有更安全有效的优点而成为植物抗病毒基因工程领域研究的热点。本研究分离纯化了马铃薯Y病毒山东分离物，以其作为今后进行山东省马铃薯抗PVY育种的基因源：利用RT-PCR方法克隆了PVY-SD的外壳蛋白基因，同时对转基因烟草免疫类型株系对PVY和PVY-SD的抗病性进行了比较实验，对山东省马铃薯Y病毒田间带毒率进行初步调查，具体研究结果如下： 1．从山东小种植的马铃薯上分离获得了马铃薯Y病毒山东分离物(PVY-SD)，PVY-SD在寄主细胞内形成风轮状的内含体，外壳蛋白亚基的分子量约为33kDa，提纯病毒粒体为长线条状，680-790×11nm。体外抗性测定表明，PVY-SD稀释限点为10~3～10~4，体外存活期为72小时，钝化温度为55～65℃。寄主反应特性研究表明，PVY-SD能侵染2科13种植物。通过以上研究初步将PVY-SD门为PVY~O株系。 2．应用改进的马铃薯Y病毒提取方法从病叶中提取病毒粒体，应用蛋白酶K法从病毒了粒体中提取病毒RNA基因组，应用RT-PCR法和特异引物从RNA基因组反转录扩增刊PVY-SD外壳蛋白基因，与克隆载体pUC19连接后通过热激法转化大肠杆菌DH5a。序列测定结果表明，PVY-SD外壳蛋白基因核苷酸序列长度为804bp，编码267个氨基酸，与GENEBANK中登录号为AJ390306；AJ223595的PVY~O分离物的同源性最高，亲缘关系最近，同源性达99％，从而从分子生物学水平上将PVY-SD划分为PVY~O株系。 3．转PVY~N非翻译CP基因的转基因烟草植株免疫型株系M11和M13对与所转的PVY~N同源性达97.8％的PVY-SD的接种表现型也为免疫类型，表明了转基因烟草在RNA水平上介导的广谱抗性。 4．通过随机取样和ELISA检测法对山东省马铃薯Y病毒田间侵染率初步调查结果表明，所调查的四个地区刘桥、界河、平阴、安丘马铃薯Y病毒的田间带毒率分别为64％、60％，56％、52％，马铃薯Y病毒的为害较为严重。