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酪蛋白（Casein,CN）约占牛奶总蛋白含量的80%,主要包含αs1-CN、αs2-CN、β-CN及κ-CN这4种类型。近年来,酪蛋白被认为是制备抗血栓肽和降血压肽等生物活性肽的优良来源,相关研究是本领域的热点之一。本研究基于对酪蛋白分子的结构以及酪蛋白的水解规律认识,以酪蛋白为原料,采用生物信息法,分别筛选预测酪蛋白中潜在的抗血栓肽和降血压肽。结合生物信息技术、圆二色谱技术、凝血分析指标（TT、APTT、PT）、凝血酶发色底物法及分子对接技术等,分析肽段的基本分子特性及抗血栓活性机理。利用生物信息技术、圆二色谱技术、高效液相ACE抑制活性分析法、Lineweaver–Burk双倒数作图法、分子对接方法,分析降血压肽的基本分子特性和活性机制。同时,通过小鼠灌胃实验,揭示了酪蛋白在小鼠体胃肠道内的消化规律及目标活性肽的体内消化释放情况。此外,采用Caco-2单层细胞模型模拟酪蛋白活性肽在小肠上的吸收情况。本研究预测了酪蛋白的分子结构,分析了酪蛋白的水解规律。采用RaptorX在线预测软件,对αs1-、αs2-、β-及κ-CN的空间结构进行预测。结果表明,αs1-CN的空间结构中包含32%的α-螺旋、4%的β-折叠和63%的环肽链;αs2-CN的空间结构中包含49%的α-螺旋和50%环肽链;β-CN的空间结构中包含21%的α-螺旋、1%的β-折叠和77%的环肽链;κ-CN的空间结构中包含3%的α-螺旋、8%的β-折叠和87%的环肽链。采用胰蛋白酶为水解模式酶,对酪蛋白的酶解规律进行分析。研究结果表明,控制水解进程,能有效控制产物的组成。随着加酶量和酶解时间增加,酪蛋白的酶解程度逐渐增加,水解产物中肽种类呈现减少的趋势。分别对酪蛋白分子中的抗血栓活性肽和降血压活性肽进行了预测。通过分析已报道的抗血栓肽的分子量分布、肽链长度、N末端氨基酸种类、C末端氨基酸种类、等电点、净电荷、亲水性及亲水性氨基酸比例,研究抗血栓活性肽的共性。结果表明,抗血栓活性肽的分子量主要集中于5001000 Da,氨基酸个数主要集中于210个,超过85%的抗血栓肽含有-22个净电荷,大多数活性肽的pI值为410,亲水性氨基酸比例为20%60%以及N末端和C末端具有各自常见的氨基酸。基于上述研究结果,利用分子排阻色谱法,以TT、APTT、PT为测定指标,对酪蛋白经胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰酶分别水解的酶解产物的分子量分布及抗血栓活性进行分析,最终选取胰蛋白酶进行后续研究。采用BLI生物膜干涉技术、UPLC-Q-TOF-MS/MS技术及生物信息技术,对胰蛋白酶酶解产物中的酪蛋白抗血栓活性肽进行筛选分析。结果表明,来自于β-CN的肽AVPYPQR（Peptide-A）具有潜在的抗血栓活性。同样,结合UPLC-Q-TOF-MS/MS及Innovagen、ProtParam、分子对接在内的计算机模拟技术,对酪蛋白降血压肽进行筛选分析。结果表明,肽NMAINPSKENLCSTFCK（Peptide-B）、EKVNELSK（Peptide-C）可能具有抑制血管紧张素转换酶ACE的活性。Peptide-A、Peptide-B和Peptide-C被确定为酪蛋白抗血栓肽和降血压肽的研究对象。本研究验证了酪蛋白潜在抗血栓肽AVPYPQR（Peptide-A）的活性,并分析了其活性机理。采用TT、APTT、PT指标,分析预测的Peptide-A的抗血栓活性。结果表明,Peptide-A（β-CN,177183）能够从内源性、外源性及共同的凝血途径抑制凝血;凝血酶发色底物法分析结果显示,此肽能够抑制凝血酶的活性。采用分子对接方法,分析肽和凝血酶的作用机制。结果表明,Peptide-A会与凝血酶的5个氨基酸残基共形成6个氢键;与凝血酶的氨基酸残基Arg67形成静电相互作用;与凝血酶的氨基酸残基Tyr76形成2个疏水相互作用。这些相互作用共同起到了稳定酶-肽复合物及抑制凝血酶活性的作用。本研究还考察了2个潜在的酪蛋白ACE抑制肽（Peptide-B和Peptide-C）的活性,并分析了它们的活性机理。ACE抑制活性分析结果表明,Peptide-B(αs2-CN,2541)和Peptide-C(αs1-CN,3542)均具有抑制ACE的活性,其IC50值分别为129.07μM和5.998 mM。采用Lineweaver-Burk双倒数方程对2个ACE抑制肽的抑制模式进行分析。结果表明,2条酪蛋白降血压肽对ACE的抑制类型均属于混合抑制。采用分子对接技术评价肽和ACE的相互作用位点。结果表明,Peptide-B与ACE共同存在时,可能被ACE水解成小片段NMAINPSKE,进而发挥抑制ACE的作用,NMAINPSKE与ACE上的10个氨基酸残基相互作用共形成15个氢键。因此,Peptide-B对ACE的混合型抑制可能部分归因于其产物肽NMAINPSKE,它通过与ACE的活性中心结合发挥抑制活性。同样,Peptide-C与ACE的分子对接分析表明,Peptide-C与ACE的9个氨基酸残基共形成15个氢键。本研究对酪蛋白活性肽的体内消化及吸收机制进行研究。采用酪蛋白灌胃小鼠,经UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定小鼠胃肠道中产生的酪蛋白肽段,结果表明,酪蛋白可经小鼠体内自然消化成含727个氨基酸的肽段,肽Peptide-B的部分片段NMAINKSE、肽Peptide-A及Peptide-C均能够在小鼠的胃中鉴定得到。说明这3种肽能够由酪蛋白体内消化产生,并且能够抵御被胃消化成更小的片段。Caco-2细胞单层膜模拟肽在小肠上的吸收结果表明,Peptide-A、Peptide-B、Peptide-C都可以穿过Caco-2细胞单层膜。