背景脓毒症是感染及其诱发的全身炎症反应。脓毒症病死率为27%,约40%脓毒症患者可出现心脏功能障碍,当出现脓毒症心肌抑制时病死率上升至70%。国外流行病学调查显示,脓毒症的全球患病率约为3/1000,全球因脓毒症死亡1.4万/天,与死于心肌梗死人数相等,成为非心脏疾病死亡的主要原因,而且治疗难度仍然很大；2012年脓毒症国际指南关于心脏功能障碍指南推荐的治疗方案是使用多巴酚丁胺,但不能改善患者预后。因此对脓毒症进行研究仍具有十分的必要性。近年来针对脓毒症的实验和临床研究一直在持续,在脓毒症发病机制和临床防治的实验研究中,通常必须借助于脓毒症动物模型,才能够更为清晰、透彻的研究脓毒症的发生发展过程,因此,脓毒症动物模型的产生与应用具有很重要的意义,且理想的动物模型能够使研究工作事半功倍。心肌损伤作为脓毒症常见的并发症,文献报道大约有40%的脓毒症患者合并有心肌抑制,合并有心肌抑制的脓毒症患者死亡率增高。脓毒症合并心肌损伤是造成脓毒症休克以及多脏器功能衰竭的关键因素,同时也是脓毒症致死的重要原因。脓毒症并发心肌损伤后,心脏血液动力学及心脏收缩力也会发生明显的变化,脓毒症休克一个典型的血流动力学特征就是是高排低阻型,就是指高心排血量、低循环阻力,也就是说,其主要的特征是对容量负荷收缩反应性的降低、收缩峰值压力／收缩末期容积比值下降、左室射血分数下降,此外,心肌损伤还表现为血浆肌钙蛋白水平和Caspase-3活性的升高,因此,这两个指标也是心肌损伤程度的标志。尽管近年来医学在器官功能支持技术和抗感染治疗方面取得了很大进步,然而脓毒症治疗仍然是一项复杂而艰巨的任务。艾司洛尔作为一种超短效高选择性的β肾上腺素能受体阻断药,临床上常用于防治严重的心律失常。该药物可以通过减少氧自由基生成,抑制中性粒细胞浸润等机制对心肌起到一定程度的保护作用。目的1.采用盲肠结扎穿刺的方法复制脓毒症大鼠模型,该模型可为脓毒症的研究提供理想的动物模型,也可为本研究下一步实验奠定基础。2.通过复制的大鼠脓毒症模型,分别对对照组、脓毒症组及艾司洛尔治疗组大鼠的心肌细胞凋亡和和心功能进行研究,从而得到脓毒症心肌细胞凋亡的情况和艾司洛尔治疗脓毒症的可行性,为临床脓毒症引发的心肌损伤提供临床前研究依据和新思路。3.在通过观察艾司洛尔对脓毒症大鼠β肾上腺能受体及心脏血流动力学的影响,探讨研究艾司洛尔改善重度脓毒症血流动力学异常的可行性。方法1.采用盲肠结扎穿刺的方法复制脓毒症大鼠模型,并观察脓毒症模型制备前后大鼠的生活习性及精神状态的变化。2.取脓毒症模型大鼠手术24 h后的腹腔积液及血液进行细菌培养,观察染菌程度；观察大鼠的脾、肺、肠、肝等脏器的外观,比较器官组织与正常大鼠的区别,并做记录；取肝、脾和肺组织放入盛有10%福尔马林的小瓶中,用于做常规病理切片检查,并做记录。3.将18只大鼠分为对照组、术后2、6、12、24、48 h组。每组3只。采用盲肠结扎穿刺法复制大鼠脓毒症模型。于相应时间点心脏取血,离心后分离血浆,检测内毒素LPS的水平。4.将30只大鼠随机分为3组,分别为对照组、CLP1组及CLP2组,分进行相应的处理。手术结束后24 h通过股静脉抽取血液标本1mL,血液标本抽取后立即采用3000 g 10 min的离心条件离心血液并分离血浆,留取血浆检测乳酸、血糖水平,将手术后48h的两组大鼠血浆乳酸、血糖水平与手术前的水平进行比较。5.将30只大鼠随机分为3组,分别为对照组、CLP1组及CLP2组,分进行相应的处理。手术结束后1周统计大鼠的死亡率。6.96只清洁级健康雄性SD大鼠(体重250±20 g)随机分为假手术组、脓毒症组、治疗组,三组大鼠建模成功后分别于3 h、6 h、12 h、24 h四个时间点、每个时间点取8只大鼠麻醉开胸,采集心脏主动脉血取血浆用以检测血浆中肌钙蛋白(cTnI)水平；同时,取2份大鼠心尖部心肌组织用以检测Caspase-3活性及心肌细胞凋亡指数。三组大鼠在最后一个时间点开胸前均先监测ILVEDd、FS和LVEF、LVPP。7.测定血浆cTnI水平。采用专用检测试剂盒检测血浆中的cTnI水平,其实验仪器和操作要求以试剂盒要求为准。8.测定血浆IL-1β的水平。采用ELISA的方法。9.测定心肌细胞中caspase-3活性。将获取的心肌组织匀浆后,离心取50μL上清液,采用专用试剂盒进行测定,并使用软件CurveExpert进一步分析,最终获得心肌细胞中caspase-3活性。10.测定心肌组织中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory, MIF)的表达,采用蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)。11.心肌细胞凋亡指数测定。心肌组织采用石蜡包埋固定,然后采用切片机进行切片,并采用常规HE染色和普通光学显微镜观察结果。在采用常规甲醛固定和石蜡包埋并脱水处理后,再进一步采用试剂盒处理,最后采用光学显微镜观察标本结果。从视野中选取5个400×的视野,通过计数获得凋亡细胞占总细胞数的比例。12.大鼠分组及处理。将大鼠随机分为假手术组、脓毒症模型组及艾司洛尔治疗组,每组20只。假手术组找到盲肠后即刻缝合腹壁切口,术后经股静脉滴注生理盐水10 ml/kg体重；脓毒血症组采用7号丝线距盲肠根部1.5 cm,血管弓内结扎盲肠,采用CLP复制脓毒症模型,术后同样经股静脉滴注生理盐水10 ml/kg体重；艾司洛尔治疗组在手术后注射艾司洛尔0.2 mg/kg体重。观察并记录术后6h、12h及18h时各组大鼠血流动力学参数指标。在心肌组织SOD活性和线粒体呼吸控制比(RCR)分析中,将大鼠随机分为假手术组、脓毒症模型组、艾司洛尔低剂量组及艾司洛尔高剂量组,每组20只。假手术组及脓毒症模型组与前操作相同,艾司洛尔组分为高剂量组和低剂量组,低剂量组术后经股静脉滴注艾司洛尔0.1 mg/kg体重,高剂量组术后经股静脉滴注艾司洛尔0.4 mg/kg体重。记录各组手术后6h及18h相关指标。13.心功能参数。各组大鼠采用股动脉插管将压力传感器连接到MedLab生物信号采集处理系统上,观察记录不同组大鼠在术后6h、12h及18h三个时间节点的平均动脉压(MAP)；采用左心室插管连接MedLab生物信号采集处理系统,记录左室收缩曲线和心电图。计算左心室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左心室最大收缩速率(+dP/dt)、左室最大舒张速率(-dP/dt)和心率(HR)。采用放射配基法分别测定各组大鼠术后6h、12h、18h四个时间节点心肌细胞p肾上腺能受体活性。14.SOD活性测定。采用试剂盒测定,操作完全根据说明书进行。15.RCR测定。将心脏置于预冷的分离介质缓冲液中,用剪刀剪碎后匀浆,采用1000转/分钟的条件离心匀浆液10 min,取离心后的上清液,再采用10000转/分钟条件离心10 min,弃去上清,用分离介质重悬沉淀物后再10000转/分钟离心10 min,所得沉淀即为提取的细胞线粒体。参照线粒体呼吸控制率RCR定量检测试剂盒说明书使用方法,计算RCR。结果1.精神状态及生活习性的变化。通过对手术前后的大鼠精神状态及生活习性的变化发现,在手术前,大鼠活泼好动；皮毛光华柔顺；嘴唇、前后爪均呈现健康红润；进食和饮水较为主动且排便正常。而制作脓毒症大鼠模型手术结束后,大鼠精神萎靡；毛发竖立；嘴唇、前后爪出现瘀红色；进食和饮水均明显减少同时大便稀溏不正常；在4h后开始出现身体发热,在17h开始出现低体温,其中有些动物呼吸加快。2.腹腔组织变化。脓毒症大鼠腹腔内多脏器有淤血点且组织出现不同程度的炎症反应；盲肠结扎处已经部分坏死,而周围组织也呈现不同程度的坏死和炎症反应,且腹腔中有较多暗红色积液,同时伴有恶臭；同时肝、肺、肾等多器官组织出现肿胀,且组织纹理发生改变,多呈现炎症性变化。3.血液和腹腔积液染菌。脓毒症模型大鼠手术后24 h的血液和腹腔积液中均培养出大量的屎肠球菌。4.内毒素水平。盲肠结扎穿刺手术后2h组、6h组、12h组、24h组及48h组大鼠血浆内毒素平均水平分别为11.53、16.42、32.59、27.15及11.50,而对照组血浆内毒素平均水平仅为0.17。很显然,手术组不用时间的检测浓度均显著(F=517.423,P<0.05)高于对照组。这一数据指示手术后不同时间,大鼠体内开始形成不同程度的炎症反应及脓毒症。5.血浆乳酸及血糖。对照组血浆乳酸水平在手术前及手术后48h基本维持稳定(F=0.083,P=0.780),而CLP1组及CLP2组在手术前及手术后48h变化比较大,均存在显著增加(P<0.05),尤其是CLP2组变化最为显著,血浆乳酸相差2倍以上。对照组血浆血糖水平在手术前及手术后48h基本维持稳定,而CLP1组及CLP2组在手术前及手术后48h变化比较大,均存在显著降低(P<0.05),尤其是CLP2组变化最为显著,血浆血糖下降接近1倍。6.死亡率。在第7天时,对照组10只大鼠未见死亡；CLP1组的存活大鼠5只,存活率为50%；CLP2组的存活大鼠仅1只,存活率为10%。这提示脓毒症大鼠模型中CLP2组更为严重,同时作为理想的脓毒症模型,很显然CLP1组大鼠更适合被用来做研究实验使用。7.光镜观察结果。三组心肌细胞在光镜下的差异较大,其中假手术组大鼠心肌细胞结构排列紧密,细胞形态正常,脓毒症组心肌细胞能够观察到大量坏死细胞,可见细胞核肿胀明显,细胞间质血管充血,还有大量的心肌纤维断层改变,艾司洛尔治疗组心肌细胞有少量水肿,坏死细胞数量较少,可见少量心肌纤维断层改变。8.血浆cTnI检测水平。假手术组血浆cTnI水平基本保持稳定(P>0.05),而脓毒症组及治疗组的血浆cTnI均高于假手术组(P<0.05),且脓毒症组在12h时间点时达最大值,治疗组在6h时间点时达最大值,治疗者同时在3h、6h、12h、24 h四个时间点比脓毒症组血浆cTnI明显降低(P<0.05)。9.心肌细胞凋亡指数的测定。与假手术组比较,脓毒症大鼠在3h、6h、12 h、24h四个时间点心肌细胞凋亡指数均明显增高(P<0.05),并随时间的延长逐渐增高。与脓毒症组比较,治疗组心肌细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)。10.血浆IL-1β检测水平。假手术组血浆IL-1β水平基本保持稳定(P>0.05),与假手术组比较,脓毒症组的血浆IL-1β水平在3h即明显升高(P<0.05),12h达到高峰(P<0.05)。与脓毒症组比较,治疗组大鼠血浆IL-1β水平在每个时间点都有降低(P<0.05)。11. Caspase-3检测活性。在3h、6h、12h、24h四个时间点,脓毒症组和治疗组的Caspase-3活性均显著高于假手术组(P<0.05),其中脓毒症组在12h时间点时达最大值,治疗组在6h时间点时达最大值,且脓毒症组Caspase-3活性在3h、6h、12h、24h四个时间点均高于治疗组(P<0.05)。12.脓毒症小鼠心肌组织MIF水平的检测。脓毒症小鼠心肌组织中MIF水平在3h、6h与假手术组比较无明显差异(P>0.05),在12h、24h明显升高(P<0.05)。艾司洛尔治疗后可明显降低12h和24h心肌组织中MIF的水平(P<0.05)。13.心功能参数。脓毒症组和治疗组24 h时间点时的LVEF、LVPP和FS均要低于假手术组(P<0.05),而LVEDd则升高明显(P<0.05),且治疗组LVEF显著高于脓毒症组(P<0.05),而治疗组LVPP与脓毒症组没有显著差异(P>0.05),这一结果说明艾司洛尔改善LVEF是通过缩小]LVEDd和增加FS来实现的。14.平均动脉血压(MAP)。与假手术组比较,脓毒症模型组大鼠手术后6h即已经出现明显的MAP下降(P<0.05),在术后18h后MAP下降几乎至术后6h时的1/2以下(P<0.05)。艾司洛尔组大鼠手术后6h的MAP水平与假手术组比较也有降低(P<0.05),但与脓毒症模型组大鼠相比则有增加(P<0.05)。15.平均心率(HR)。与假手术组比较,脓毒症模型组大鼠手术6h后HR出现明显增快(P<0.05),但是随着时间的增加,HR存在明显的下降趋势,在术后12h及18h与假手术组相比心率明显减慢,差异有显著性(P<0.05)。艾司洛尔治疗组大鼠手术后6 h、12及18h的HR水平与假手术组相比存在显著性差异(P<0.05),但与脓毒症模型组大鼠相比,HR更加稳定。16.平均左室舒张末压(LVEDP)。与假手术组比较,脓毒症模型组大鼠手术后6h即已经出现明显的LVEDP下降(P<0.05),并且随着时间的增加,LVEDP下降的越来越明显(P<0.05)。艾司洛尔组大鼠与脓毒症相比有明显的增加(P<0.05)。17.左心室收缩压(LVSP)。与假手术组比较,脓毒症模型组大鼠手术后6 h、12h及18h时的LVSP可见明显降低,差异有显著性(P<0.05)；与脓毒症模型组比较,艾司洛尔组大鼠LVSP可见明显增高,差异有显著性(P<0.05)；18.左心室最大收缩速率(+dP/dt)。与假手术组比较,脓毒症模型组大鼠手术后出现明显的+dP/dt下降(P<0.05)。艾司洛尔组与脓毒症模型组大鼠相比则有明显增加(P<0.05)。19.左室最大舒张速率(-dP/dt)。与假手术组比较,脓毒症模型组大鼠手术后有明显的-dP/dt下降(P<0.05)。艾司洛尔治疗组大鼠手术后-dP/dt水平与假手术组比较存在一定的降低(P<0.05),但与脓毒症模型组大鼠相比则有一定的增加(P<0.05)。20.心肌细胞p肾上腺能受体活性。假手术组大鼠的心肌细胞p肾上腺能受体活性最高,艾司洛尔治疗组大鼠的心肌细胞p肾上腺能受体活性次之,脓毒症模型组大鼠的心肌细胞p肾上腺能受体活性最低(P<0.05)。21.心肌组织SOD活性。相比假手术组大鼠的心肌组织SOD活性,其他三组的心肌组织SOD活性均有不同程度的下降(P<0.05)；与脓毒症模型组相比,艾司洛尔低剂量组及艾司洛尔高剂量组的心肌组织SOD活性均有不同程度的增加(P<0.05)；艾司洛尔低剂量组和艾司洛尔高剂量组相比较,高剂量的艾司洛尔条件下大鼠的心肌组织SOD活性显然更高(P<0.05)。22.线粒体呼吸控制比(RCR)水平。相比假手术组,其他三组的心肌细胞线粒体RCR均有不同程度的下降(P<0.05)；与脓毒症模型组相比,艾司洛尔低剂量组及艾司洛尔高剂量组的心肌细胞线粒体RCR均有不同程度的增加(P<0.05)；艾司洛尔低剂量组和艾司洛尔高剂量组相比较,高剂量的艾司洛尔条件下大鼠的心肌细胞线粒体RCR显然更高(P<0.05)；另外,除假手术组外,其他三组18 h时的心肌细胞线粒体RCR均较6h时的心肌细胞线粒体RCR有不同程度的下降(P<0.05)。结论1.本章通过采用CLP方法成功制作了大鼠脓毒症模型,并通过不同的手段为大鼠脓毒症模型成功建立提供了证据,首先CLP前后大鼠精神状态、体征及生活习性包括进食、饮水、排便等习性发生了明显的变化,CLP后的大鼠明显精神萎靡、毛发竖立、嘴唇和前后爪出现瘀红色、进食和饮水均明显减少同时伴随大便稀溏不正常；其次CLP后的大鼠解剖和病理切片显微也观察分析了脓毒症模型大鼠的变化,CLP后的大鼠多器官组织出现肿胀,且组织纹理发生改变,多呈现炎症性变化,同时血液和腹腔积液培养结果也显示含有屎肠球菌；最后分别将CLP后不同时间的大鼠的血浆中内毒素进行检测结果也显示,实验组的内毒素含量明显高于对照组大鼠。此外,还对血浆乳酸及血糖浓度进行了检测,结果显示,手术结束48h后乳酸明显升高,血糖明显降低；在对手术后1周的死亡率统计结果显示,CLP1组的存活率50%,CLP2组的存活率10%,很显然CLPI组更为理想,这也说明手术位置很重要,关系着脓毒症的成功与否。以上结果均提示本章成功采用CLP法建立了大鼠脓毒症模型,并采用不同的方法验证了大鼠脓毒症模型。2.本研究通过比较对照组、脓毒症组及艾司洛尔治疗组之间的心肌组织细胞切片、血浆cTnI水平、血浆IL-1β、Caspase-3活性、心肌组织MIP的水平及血流动力学等指标结果显示,脓毒症组大鼠在手术之后随着时间的增加血浆cTnI水平和Caspase-3活性水平显著增加,血浆IL-1β在脓毒症3h即明显增加,心肌组织MIP的水平在12h才明显增加,考虑IL-1β为早期炎症介质,MIP为晚期炎症因子。由于血浆cTnI水平及Caspase-3活性水平均为心肌损伤和凋亡的主要指标,因此血浆cTnI升高明显提示脓毒症状态下心肌损伤严重,这一结果与光学显微镜所观察到的大量坏死心肌细胞的结果一致；艾司洛尔治疗组大鼠血浆IL-1β在观察的时间点均有明显降低,MIP水平在12h及24h有明显降低,说明艾司洛尔可以降低早期及晚期炎症反应。艾司洛尔治疗组大鼠血浆cTnI水平和Caspase-3活性水平较脓毒症组有显著的降低,这说明艾司洛尔治疗组心肌损伤程度及心肌细胞凋亡指数都要低于相比脓毒症组,这提示艾司洛尔具有改善脓毒症引发的心肌损伤,可能机制为艾司洛尔可以降低炎症反应；另外,在使用艾司洛尔后,大鼠心率稳定,心功能的抑制症状反而显著改善,这也从另一方面说明了脓毒症时由于心每搏出量降低而代偿性的通过增加搏出次数来满足机体需要的事实。事实上,除了减慢心率外,艾司洛尔还具有抑制β肾上腺素能系统发挥功能、减轻炎症反应、抑制心肌细胞凋亡的作用。由此可见,针对脓毒症患者采用短效β受体阻断剂艾司洛尔可以促使血流动力学保持稳定,并有效的改善心功能。综上所述,在脓毒症早期使用艾司洛尔能够有效的抑制脓毒症发展过程中的心肌损伤及心肌细胞凋亡并获得相对稳定的血流动力学,从而减轻脓毒症带来的心功能抑制。3.在本研究中脓毒症模型大鼠手术后出现动脉压的下降,而艾司洛尔治疗组能增高其平均动脉压,提示艾司洛尔有提高脓毒症大鼠平均动脉压的作用；在CLP术后6 h,各组大鼠均出现不同程度的心率增快,考虑系应激反应代偿所致,而12h开始,由于失代偿出现心脏抑制,心率减慢,同样,艾司洛尔能调节大鼠心率,使代偿期大鼠心率减慢,而失代偿期大鼠心率增快。在本实验中另一项重要的研究内容显示,艾司洛尔对心功能的改善也非常明显。LVEDP代表左心室前负荷、间接反映心室舒张顺应性,LVSP则主要反映心肌收缩能力,+dP/dt及-dP/dt则是反映室壁张力变化快慢,因此,LVEDP、LVSP、+dP/dt及-dP/dt四个指标均是反映心肌功能的敏感指标。本研究发现艾司洛尔能显著改善上述指标,提示艾司洛尔能改善脓毒症模型大鼠的心脏收缩和舒张功能失常,在预防和治疗脓毒症诱导的心肌功能障碍中能起到重要的作用。本研究结果还显示,脓毒症大鼠手术后6h、18h两个时间节点中的心脏RCR水平显著下降(P<0.01),提示脓毒症时心肌细胞线粒体能量代谢功能受到严重损伤；同时结果也显示,注射了低、高两种浓度艾司洛尔后治疗组大鼠SOD活性及RCR水平均得到有效控制,且这一作用效果与艾司洛尔的使用剂量成正比。因此,艾司洛尔能够显著改善心肌细胞线粒体的氧代谢过程,从而改善心肌细胞线粒体氧化供能能力。综上,艾司洛尔用于辅助治疗脓毒症可有助于稳定心率,改善心脏血流动力学从而起到改善心功能。