膜蛋白在生物体内参与了许多非常重要的过程,涉及物质运输,细胞的存活、增殖、分化,形态的发生与器官的形成等等各种信号的通路。对膜蛋白功能的研究一直都是比较活跃的领域。鉴于所发挥的重要功能,膜蛋白还被认为在疾病的诊断和治疗上都具有重要的地位。因此研究各种膜蛋白的功能对于阐明生物活动的规律是十分必要的。蛋白质总是通过和其它的蛋白或核酸相互作用而参与了细胞中的各种生命活动。以转录因子重构为基础的酵母双杂交是研究蛋白之间相互作用的非常有效的遗传学方法,并在功能蛋白质组研究中得到了广泛应用。但这种方法是将被研究的蛋白强制性地定位于细胞核内,不适合膜蛋白的研究。基于断裂泛素重组(split-ubiquitin)的酵母双杂交方法就是为满足膜蛋白研究的需要应运而生的,更适宜于研究膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白之间的相互作用。为方便研究膜蛋白之间或膜蛋白-可溶蛋白之间的相互作用,本课题的研究工作构建了一套split-ubiquitin膜蛋白酵母双杂交系统,为膜蛋白的研究提供了一个有效的平台。Split-ubiquitin酵母双杂交方法的原理是利用连接有泛素(ubiquitin)的蛋白能够被泛素特异性的蛋白酶(UBPs)识别并切割下泛素,而这种特异性切割只在泛素能够正确折叠的前提下发生。在正常情况下,泛素断裂成两部分后在体内能自发结合成可被UBPs识别的重构泛素,而当有突变发生时,即泛素的N端发生Ile13/Gly13的突变,这种断裂泛素的重构就无法进行。只有当与断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白,且两个蛋白之间存在相互作用,断裂泛素的重组又得以恢复。断裂泛素重组的发生能将连接在泛素C端的转录因子切割并进入细胞核内激活报告基因的转录表达,通过报告基因是否表达,可以检测两个蛋白之间是否存在相互作用。根据这一原理,本研究课题构建了一套基于断裂泛素重组(split-ubiquitin)的酵母双杂交系统,并经过LASS2和VPL,一对能相互作用的人的膜蛋白的验证,可用于筛选膜蛋白相互作用的蛋白质。系统主要包括了含泛素C端部分(Cub)的pBait质粒,可克隆bait蛋白;含泛素N端部分(NubG)的pPrey质粒,可构建cDNA文库;含完整泛素(ubiquitin)的阳性对照质粒,可作为双杂交筛选时报告基因表达的阳性对照。与其它实验室已报道过的系统相比较,本系统的特点是:pBait和pPrcy质粒都是强启动子(ADH1和GAL1)、高拷贝数载体,相对地提高了相互作用蛋白的表达量,对于筛选较弱的相互作用具有一定的优势;pPrey质粒选用的诱导型启动子GAL1,使得prey蛋白的表达可受诱导物半乳糖的调控,能筛选对细胞有潜在毒性作用的蛋白。为验证新构建的split-ubiquitin酵母双杂交系统的有效性和实用性,本课题还分别以线粒体膜蛋白BNIP3和结核杆菌胞壁蛋白Wag31为诱饵蛋白,利用这套系统筛选了与它们相互作用的蛋白,研究了BNIP3在凋亡中的作用,探讨了Wag31在结核杆菌致病中的作用。BNIP3,是Bcl-2家族中含有单一BH3 domain的亚家族中一个成员,具有促细胞凋亡的功能。但同亚家族中的其它成员相比,BNIP3有其独特之处,其所诱导的凋亡不依赖于caspase的激活和细胞色素c的释放,并造成线粒体功能的破坏。而且BNIP3可能还参与了细胞自吞过程。但具体的过程并不十分清楚。BNIP3的C端含有一段跨膜区将其定位在线粒体膜上发挥功能。利用本课题构建的膜蛋白酵母双杂交系统筛选到ACAA2,Acetyl-Coenzyme A acyltransferase 2,是BNIP3相互作用的蛋白,能够减弱BNIP3在HepG2和U-2 OS细胞中诱导的凋亡和对线粒体功能的破坏。这对深入理解BNIP3的功能提供了新的证据,并在凋亡和脂肪酸代谢之间建立了可能的联系。这套系统的另一个应用是研究结核杆菌的致病机制。随着结核病的卷土重来,结核杆菌对人类健康的威胁越来越大,每年死于结核病的人已达200万。但对这种病原菌的致病机制的了解还非常有限。Wag31(Rv2145c)最初是从麻风病和结核病人的血清中作为致病的抗原被鉴定出的,这提示Wag31可能在结核杆菌的致病机制中发挥了重要作用,但像结核杆菌编码的很多蛋白一样,对其功能的研究还在初级阶段。以Wag31为bait,利用构建的系统首次发现趋化因子家族的成员之一XCL2能与Wag31发生相互作用,且Wag31能特异地激活XCL2在巨噬细胞中的表达。结果不仅把表达XCL2趋化因子的细胞类型扩大到巨噬细胞,还为阐明wag31和XCL2的生理和病理的重要性提供了新的思路。