第一章乙型肝炎病毒母婴传播防治的临床研究第一部分不同喂养方式对乙型肝炎病毒母婴传播的影响目的:探讨母乳喂养是否增加乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatitisB virus,HBV)母婴传播的风险,以及母孕期乙肝e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)阳性对新生儿HBV免疫应答有无影响。方法:本研究对674例母孕期乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性的新生儿进行随访,包括母乳喂养儿491例和人工喂养儿183例。所有新生儿出生后均接种过乙肝疫苗,416例(61.7%)同时注射乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin,HBIG)。其中179例(26.6%)儿童的母亲孕期乙肝e抗原(hepatitisBe antigen,HBeAg)阳性。随访时采血检测儿童HBV血清学标志物。结果:674例儿童(其中男童368例)随访时1-7岁(平均4.1 ± 1.7岁),其中17例(2.5%)HBsAg阳性,提示HBV慢性感染。母乳喂养组儿童慢性感染率为1.6%(8/491),低于人工喂养组儿童(4.9%,9/183),差异有统计学意义(χ2=4.603,P= 0.015)。母乳喂养组儿童的自限性感染率,即乙肝核心抗体(antibody against hepatitis core antigen,抗-HBc)阳性但HBsAg阴性,亦低于人工喂养组(2.0%vs.4.9%,P= 0.044)。其原因可能与人工喂养组儿童的母亲孕期HBeAg阳性率明显高于母乳喂养组有关(52.5%vs.16.9%,P<0.001)。所有慢性感染儿童的母亲孕期HBeAg均阳性,提示孕妇HBeAg阳性是HBV母婴传播的重要危险因素。因此,我们进一步分析了 179例孕期HBsAg和HBeAg同时阳性母亲不同喂养方式的子女HBV感染情况。83例母乳喂养的儿童慢性感染和自限性感染率分别为9.6%和6.0%,均与人工喂养组儿童(96例)的感染率相近(慢性感染率9.4%,P=0.952和自限性感染率8.3%,P = 0.553),其中两组孕妇HBV DNA水平相近(6.32 × 107 IU/ml vs.5.48 × 107 IU/ml,P=0.418)。Logistic 回归证实母乳喂养并不是HBV母婴感染的独立危险因素。此外,经免疫预防后,无慢性HBV感染的657例儿童抗-HBs阳性率为77.9%,抗体中位数浓度68.3 mIU/ml。母乳喂养组和人工喂养组儿童随访时的抗-HBs阳性率(78.5%vs.76.4%,P = 0.580)和抗体水平(73.4mIU/ml vs.56.8 mI/ml,P=0.963)均无统计学差异。母孕期HBeAg阳性和HBeAg阴性的儿童抗-HBs免疫应答情况亦相似。结论:HBsAg阳性母亲的新生儿经免疫预防后,母乳喂养并不增加HBV母婴传播风险。因此,临床工作中,医务人员应鼓励包括HBeAg阳性在内的HBV携带产妇对其新生儿进行母乳喂养。此外,尽管母孕期HBeAg阳性是HBV母婴感染的重要危险因素,但并不影响其新生儿抗-HBs免疫应答水平。第二部分:分娩方式对乙型肝炎病毒母婴传播的影响目的:探讨在联合免疫预防情况下,剖宫产能否进一步降低乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatitis B virus,HBV)母婴传播的风险。方法:本研究对江苏地区674例乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性孕妇的新生儿进行随访,随访时1-7岁(平均4.1 ±1.7岁),根据分娩方式不同,分为剖宫产357例(53.0%)和经阴道分娩317例(47.0%)。其中179例(26.6%)儿童的母亲乙肝e抗原(hepatitis Be antigen,HBeAg)同时阳性。所有新生儿出生后均接种了乙肝疫苗,416例(61.7%)同时注射乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin,HBIG)。随访时采血检测HBV血清标志物。分析新生儿免疫预防情况,并比较HBsAg阳性母亲不同分娩方式的子女HBV感染率。结果:674例随访儿童中,17例(2.5%)HBsAg阳性,提示慢性HBV感染;19例(2.8%)HBsAg阴性,但抗-HBc阳性,提示自限性感染。17例慢性感染儿童中,13例未使用HBIG或延迟接种乙肝疫苗,提示可能与免疫预防措施不当有关。剖宫产组和经阴道分娩组儿童HBsAg阳性率分别为2.8%和2.2%,差异无统计学意义(P = 0.624)。同样地,两组自限性感染率分别为2.2%和3.5%,亦无统计学差异(P=0.336)。进一步对179例孕期HBsAg和HBeAg同时阳性母亲的儿童进行分析,包括剖宫产96例和经阴道分娩83例,其中两组母亲HBVDNA水平相近(6.18× 107 vs.5.99 × 107 IU/ml,P = 0.587)。剖宫产组儿童的慢性感染率和自限性感染率分别为10.4%和4.2%,均与经阴道分娩组相近(慢性感染8.4%,P=0.652和自限性感染10.8%,P=0.086)。另外,不论母孕期HBeAg阴性还是阳性,HBsAg阳性母亲不同分娩方式的子女抗体应答率和抗体滴度均无统计学差异。结论:经免疫预防后,HBV携带母亲不同分娩方式的子女感染率相似,说明剖宫产并不能减少HBV母婴传播。因此,对HBsAg阳性孕妇不应为阻断HBV母婴传播而选择剖宫产。第三部分孕妇乙型肝炎病毒携带对新生儿围产期结局及远期生长的影响目的:阐明母孕期乙型肝炎(乙肝)表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带是否增加不良妊娠结局发生的风险或影响其子女远期生长。方法:回顾性调查2002-2004年江苏地区380例HBsAg阳性和428例HBsAg阴性单胎孕妇的新生儿结局。比较两组新生儿出生体重和身长,以及有无早产、死胎或死产、新生儿死亡和先天性畸形等不良妊娠结局。2009年10月至2010年3月期间对这些儿童进行随访,采血检测HBV血清标志物,并记录其生长情况,包括身高、体重和一般健康状况。结果:HBsAgp阳性孕妇的新生儿出生体重和身长分别为3436.1 ± 388.1 g和49.8 ±2.4 cm,与 HBsAg 阴性组相近(体重 3466.4 ± 435.2,P=0.308;身长 49.9 ± 2.4 cm,P=0.769)。新生儿总体早产率为2.1%(17/808);HBsAg阳性组新生儿早产率略高于HBsAg阴性组(2.9%,11/380 vs.1.4%,6/428),但差异无统计学意义(P=0.140)。两组死胎或死产(0.5%vs.0.2%)、新生儿死亡(0.5%vs.0.5%)和先天性畸形(0.8%vs.1.4%)等不良妊娠结局的发生率相近(P均>0.05)。Logistic回归证实母孕期HBsAg携带与不良妊娠结局无关(P均>0.05)。儿童5-7岁时,随访到271例(71.3%)HBsAg阳性母亲的子女和297例(69.4%)HBsAg阴性母亲的子女。相似地,两组儿童随访时体重(22.7 ± 3.8 kg vs.22.7 ± 4.4 kg,P = 0.960)或身高(116.8 ±7.1 cm vs.117.0 ±9.8 cm,P = 0.860)亦无统计学差异。此外,随访时HBsAg阳性组有1例(0.26%)儿童诊断为脑瘫,而HBsAg阴性组有4例(0.93%)表现异常,包括1例智力低下、2例先天性聋哑及1例因新生儿肺炎而死亡。两组均无孕产妇死亡发生。结论:母孕期HBsAg携带并不增加不良妊娠结局风险或影响其子女的远期生长。第二章巨细胞病毒重组多肽检测特异性IgG抗体及抗体亲合力的初步评价目的:评价原核细胞表达的巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)重组多肽是否适合于检测CMV特异性IgG抗体及抗体亲合力指数(avidity index,AI)。方法:采用分子克隆技术构建含有CMV较强抗原性多肽基因序列的重组抗原克隆,进行诱导表达及纯化。在此基础上,以纯化的重组蛋白多肽作为包被抗原,包括被膜磷蛋白pp150、pp28、非结构蛋白pp52和包膜糖蛋白gB,建立检测CMV特异性IgG抗体的间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。用此方法检测200例血清样本,并与意大利进口 ELISA试剂盒检测结果相比较。进一步选取与试剂盒检测符合率较高的重组多肽,在重组抗原ELISA基础上进行尿素变性实验,检测原发感染和潜在感染患者的血清,以判断其是否适合于CMV IgG AI的检测。结果:成功构建了 8种重组多肽的表达质粒,并获得了纯化的蛋白多肽,包括pp150/1(aa 1-555)、pp150/2(aa555-705)、pp150/3(aa862-1048)、pp150/4(aa 555-1048)、pp28(aa 1-191)、pp52/1(aa 297-434)、pp52/2(aa 1-434)和 gB(aa 552-635)。检测特异性IgG抗体时,与试剂盒检测结果相比(126例阳性和74例阴性),重组多肽pp150/4检测时阳性符合率最高(90.9%),其次为多肽pp150/3(89.7%)、pp150/2(88.9%)和 pp150/1(80.2%),提示 CMV 抗原表位主要位于pp150的羧基端。此外,尽管重组多肽gB检测时阳性符合率较低(38.9,49/126),然而其检测时阴性符合率最高(98.6%,73/74),其次为重组多肽pp150/4(97.0%)、pp1 50/3(95.9%)、pp150/2(94.6%)和 pp1 50/1(89.2%)。进一步选取与试剂盒检测一致性较高的重组多肽pp150/2、pp150/3和pp150/4用于检测CMVIgG AI。以重组多肽pp150/4为例,在初步检测经进口试剂盒确定为原发感染的8例血清(AI值15.3-29.8)时,其中4例标本AI值>30%(39.0-60.4),与进口试剂检测值(17.2-26.2)不相符。而检测7例明确为潜在感染的血清(AI 59.6-92.3)时,其中2例AI值分别为22.9和25.1,提示原发感染,与进口试剂盒检测结果并不一致。同样,重组多肽pP150/2和pp150/3检测的AI值与进口试剂盒检测值亦相差较大。结论:高效表达纯化的重组蛋白pp150具有良好的抗原性,利用其建立的间接ELISA方法,可用于检测CMV特异性IgG抗体。然而,根据重组抗原pp150检测的CMV IgG AI值并不能准确判断患者感染状态,因此并不适合于CMV特异性IgG抗体亲合力检测。