论文部分内容阅读
子宫是雌性哺乳动物重要的繁殖器官,许多至关重要的细胞学事件和生物学过程在子宫中完成,如胚胎植入、蜕膜化、胎盘形成和分娩等。因此,探讨并阐明雌性动物子宫功能作用机制及其影响因素具有重要意义。近年来,越来越多证据骨形态发生蛋白家族(Bone morphogenetic protein, BMP)和一氧化氮(Nitric oxide, NO)在子宫机能和发育过程中发挥重要作用,如Bmp2参与蜕膜化过程,NO具有调控子宫肌收缩作用。鉴于此,本试验通过建立不同动物模型以研究Bmp2/4信号通路相关成员在雌鼠子宫中的表达,同时也研究NOS和sGC在出生后猪子宫中的细胞表达与定位,主要发现和结论如下：1 Bmp2/4信号通路相关成员在出生后仔鼠子宫中的动态表达本试验通过实时荧光定量PCR方法探讨骨形态发生蛋白2和4及其信号通路上的相关成员在出生后第1,3,10,15,21和29日龄仔鼠子宫中的表达模式。结果发现,Bmp2 mRNA表达水平在出生后整个阶段呈现上升趋势,并出生后D21和D29天相对较高。Bmp4的表达水平呈现波浪式的表达趋势,特别是在出生后D15和D29达到最高表达丰度。此外,Bmp2和Bmp4差异显著(P<0.05)。Bmpr1a在出生后D3和D29表达量显著高于其它时期。Bmpr1b和Bmpr2的表达水平呈逐渐上升趋势。与Bmpr1a和Bmpr2相比,Bmpr1b的表达水平显著低于相应时期Bmpr1a和Bmpr2的表达水平(P<0.05)。三种R-Smads差异地表达于仔鼠的子宫并且Smad1和Smad5的表达水平显著高于Smad8。Smad4在整个出生后发育阶段呈现“波浪状”的表达,在出生后D3、D15和D29表达水平较高,其它时期无显著变化。结果暗示Bmp2/4信号通路在出生后仔鼠子宫内膜间质细胞的组织和分化及子宫内膜维持发挥重要的调控作用。2 Bmp2/4信号通路相关成员在发情周期雌鼠子宫中的表达与定位本试验通过实时荧光定量PCR法和免疫组化方法探讨骨形态发生蛋白2和4信号通路相关成员在发情周期雌鼠子宫中的表达与定位。定量结果显示发情前期Bmp2的表达水平显著高于发情期和发情后期。Bmp4的表达水平呈现明显的波动。Bmp2和Bmp4在发情周期的大多阶段并没有显著差别。Bmpr1a和Bmpr2的表达水平在整个发情周期没有显著变化。然而Bmprlb的表达水平在发情期显著下降(P<0.05),但在发情后期则显著上升(P<0.05)。此外,与Bmprla和Bmpr2相比,Bmpr1b的表达水平在相应的发情阶段显著低于两者(P<0.05)。三种R-Smads差异地表达于雌鼠的子宫并且Smad1的表达水平显著高于其它R-Smads。此外,Smad4的表达水平在整个发情周期没有显著变化。免疫组化试验结果表明BMP2蛋白贯穿于发情周期的各个阶段,差异并主要定位于子宫腔上皮和腺上皮细胞。骨形态蛋白家族成员差异的表达于雌鼠子宫支持一种假设即BMP信号通路差异地参与到发情周期雌鼠子宫内膜的退化和重塑。我们的发现对于探索导致雌鼠子宫周期性变化的机制提供有效的依据。3 Bmp2/4信号通路相关成员在雌鼠妊娠过程中子宫中的表达与定位本试验通过放射免疫测定法和实时荧光定量PCR方法探讨卵巢类类固醇激素和骨形态发生蛋白家族成员在妊娠雌鼠子宫中的角色。放免试验结果显示雌激素浓度在妊娠D5和D7达到最低值,在妊娠的其它时期没有发生显著变化。孕激素的浓度在妊娠早期和妊娠中期呈上升趋势,之后呈下降趋势并在妊娠D18达到最低值。P/E值在妊娠早期逐渐上升,分娩前达最低值。定量结果显示Bmp2的表达水平在妊娠早期逐渐上升,并在妊娠D7天达到顶峰(P<0.05),在妊娠D12天急剧下降。相比之下,Bmp4的表达水平呈现波动,特别是分娩后PP3显著高于妊娠其它时期(P<0.05)。Bmp2和Bmp4差异显著(P<0.05)。Bmpr.1a勺表达水平从妊娠D1天至D12天呈下降趋势,之后呈现上升趋势。Bmpr1b的表达水平在妊娠D3天显著高于着床其它阶段表达(P<0.05)。并且,Bmpr1b的表达水平从妊娠D12至分娩后没有显著变化,但在分娩后D3天显著上升(P<0.05)。Bmpr2的表达水平在分娩前没有显著变化,但在分娩后显著上升。此外,Bmpr1b的表达水平显著低于妊娠相应时期Bmpr1a和Bmpr2 mRNA的表达水平(P<0.05)。三种R-Smads差异地表达于雌鼠的子宫并且Smadl和Smad5的表达水平显著高于Smad8 (P<0.05)。Smad4在表达水平在整个妊娠过程和分娩PP1没有显著变化,但在分娩PP3天显著上升(P<0.05)。结果表明,卵巢类固醇激素和Bmp2/4在妊娠建立、维持和分娩过程中发挥重要的调控作用。4 Bmp2/4信号通路在围着床期雌鼠子宫中的角色与激素调控本试验旨在研究骨形态蛋白2/4家族成员在围着床期子宫中mRNA的时间表达谱及卵巢类固醇激素及其受体拮抗剂对其调控。结果显示,Bmp2的表达水平在围着床期呈现上升趋势,并在妊娠D7天达到最水平。Bmp4的表达水平D1至D3天逐渐上升,从D4开始逐渐下降。Bmp2和Bmp4差异显著(P<0.05)。除了Bmpr1a和Bmpr2 mRNA在围着床期D4仍然高水平表达,Bmpr的表达模式与Bmp4基本相似。Bmpr1b的表达水平显著低于妊娠相应时期Bmpr1a和Bmpr2 mRNA的表达水平(P<0.05)。三种R-Smads差异地表达于雌鼠的子宫并且Smad1和Smad5的表达水平显著高于Smad8。Smad4的表达水平在D2、D3、D4、D5显著高于围着床期的其它时期(P<0.05)。此外,切除卵巢鼠注射E2引起体重增加(P<0.05),而在其它组别无此现象。P4和E2同时处理可上调Bmp4 mRNA的表达(P<0.05)。结果暗示Bmp2/4信号通过在啮齿类动物蜕膜化过程中发挥至关重要的作用,并且卵巢类固醇激素是BMP家族的潜在调控者。5一氧化氮合酶和可溶性鸟苷酸环化酶在出生后猪子宫中的细胞特异性表达与定位当前研究的目的是探讨一氧化氮合酶(NOS)和可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)在出生后子宫中的细胞表达与定位。免疫组化实验结果显示三种NOS主要定位在子宫腔上皮、腺上皮和子宫肌层,并且iNOS和eNOS的染色强度随着出生后子宫发育而增加。此外,可溶性鸟苷酸环化酶(sGCal和sGCβ)主要定位于子宫腔上皮、腺上皮、子宫肌层和间质细胞。子宫NOS活性数据表明总NOS活性和iNOS活性在出生后第21天(P<0.05)和第35天显著升高(P<0.05)。组成型NOS活性第21天升高(P<0.05),但它在第35天下降(P<0.05)。免疫印记显示iNOS蛋白表达在第21天(P<0.05)和第35天(P<0.05)显著升高。此外,sGCα1蛋白表达没有发生显著变化。总之,我们的发现暗示NO/cGMP信号参与出生后子宫发育过程。综上所述,本文通过不同动物模型和real time PCR、IHC以及western blot等试验方法研究了Bmp2/4信号通路在不同模型雌鼠子宫中的表达以及NO/cGCMP信号通路在出生后猪子宫中的表达与定位。结果表明Bmp2/4信号通路主要通过细胞增殖、分化和凋亡方式参与到子宫内膜间质细胞组织和分化、子宫内膜退化与重塑、胚胎植入、蜕膜化和妊娠等生理过程。NO/cGCMP信号通路则抑制子宫肌收缩,使子宫处于松弛状态。