研究背景:肾上腺皮质癌(Adrenocortical carcinoma,ACC)是一种来源于肾上腺皮质的上皮性恶性肿瘤,临床罕见,每年的发病率约为1-2/100万人,发病多见于两个年龄高峰,<5岁的儿童和50岁左右的成人,平均发病年龄45岁,女性发病率略高于男性。ACC的病理生理机制仍未能明确,目前认为ACC的病理是一个多因素参与的复杂过程,染色体畸变、基因突变、DNA的甲基化,胰岛素样生长因子(IGF)和Wnt/β-catenin信号通路的功能异常都对ACC的发生发展起重要作用。ACC恶性程度高,多数肿瘤直径>5cm,平均10cm,瘤体内多伴有出血及坏死,病程进展迅速且隐匿,大多数患者就诊时已属癌症晚期,伴发有淋巴或远处器官转移,最常见于肺、肝、腹膜后淋巴结和骨转移。ACC的临床表现由肿瘤的功能和体积决定,大多数成人ACC具有内分泌功能,分泌皮质醇和性激素的库欣综合症(Cushing’syndrome,CS)以及男性化在临床中最为常见,约占ACC的40%,单纯CS和男性化表现分别占30%和20%,女性化约占10%,分泌醛固酮的ACC临床中较为少见,约2%。儿童ACC90%以上具有内分泌功能,临床表现多为男性化或假青春期表现,其中以分泌雄激素的肿瘤最为多见,约占儿童ACC的55%以上,混合分泌皮质醇和雄激素的占30%,单纯分泌皮质醇的肿瘤较少见,不足5%。非功能性的ACC因起病隐匿,一般临床表现多以肿瘤进展后引起的腹部症状为主。影像学和内分泌检查是临床诊断ACC的主要手段。目前ACC的治疗由于缺乏特效的化疗和靶向治疗药物,手术仍是其主要的治疗手段,但30%-85%患者就诊时肿瘤已处于进展期,伴发有淋巴或其它脏器转移,无法进行有效的手术切除或根治性手术切除,平均生存期仅为3～9个月,大部分生存时间不超过1年,5年生存率不到15%,即使手术治疗后的患者5年生存率也不足30%。所以对于无法进行手术或无法进行根治性手术的患者仍须考虑药物治疗,或是术后辅以药物治疗来延长期生存时间。ACC药物治疗国外推荐使用米托坦,但其有效性及安全性仍存在争议。EDPM(顺铂、依托泊甙、多柔比星、米托坦)和Sz/m(链霉素、米托担)是米托坦联合细胞毒性药物作为进展期ACC的一线治疗方案,但总的疗效也非常有限。放疗、射频消融、介入栓塞只能使少数患者受益,因此为了有效提高ACC患者的生存率,手术联合药物治疗仍是一项重要的研究课题。由于ACC对传统的化疗药物不敏感,所以寻找有效的、安全的、高选择性药物也是当今研究ACC治疗的重点。氯硝柳胺(Niclosamide),又名灭绦灵,化学名:N-(2’-氯-4’-硝基苯)-5-氯水杨酰胺,分子式C13H8C12N2O4,临床中用来治疗人肠道寄生虫病,是美国食品药品监督管理局(FDA)推荐治疗蠕虫的药物。作用机制通过抑制虫体细胞内氧化磷酸化过程和线粒体功能、阻断NADPH向NADP+的转化、抑制ATP的产生、改变细胞能量代谢发挥治疗作用。近年来,在抗肿瘤药物的的研发过程中,通过大量的药物筛选实验发现氯硝柳胺还具有潜在的抗肿瘤作用,相对于新研究合成的抗肿瘤药物,氯硝柳胺具有细胞毒性强,人体毒副作用小的优势。WANG于2009报道氯硝柳胺可以抑制白血病细胞K562靶基因蛋白的表达,随后其他学者在研究中发现氯硝柳胺可以通过影响 Wnt/β-catenin、mTORC1、STAT3、NF-κB、Notch、Hedgehog 等信号通路和肿瘤细胞内线粒体、溶酶体来产生抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用,进一步研究发现氯硝柳胺不仅作用于肿瘤细胞,还可以作用于拥有自我更新能力并能产生异质性细胞的肿瘤干细胞。除此之外,在另一些研究中还发现,氯硝柳胺能够增加肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性,甚至可以逆转肿瘤细胞对化疗和放疗的耐受性。氯硝柳胺对正常细胞的能量代谢和信号传导影响甚微,作为潜在的抗肿瘤药物展现出良好的应用前景。研究目的:1.研究氯硝柳胺对人肾上腺皮质癌SW-13细胞株细胞增殖、周期、凋亡和迁移力、侵袭力的影响并初步探讨其机制。2.研究氯硝柳胺对肾上腺皮质癌SW-13细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用和机制。研究方法:1.通过体外培养SW-13细胞,采用CCK-8法和iCELLigence实时无标记细胞增殖监测仪检测不同浓度氯硝柳胺对SW-13细胞增殖的影响。2.采用流式细胞技术检测氯硝柳胺作用SW-13细胞后对细胞周期分布率的影响。3.采用AO/EB染色法和Annexin V/PI染色流式细胞技术检测氯硝柳胺作用SW-13细胞后对细胞凋亡率的影响。4.采用Transwell实验和细胞划痕实验检测氯硝柳胺作用SW-13细胞后对细胞侵袭力、迁移能力的影响。5.采用Western Blotting检测氯硝柳胺作用SW-13细胞后对β-catenin、LRP6、vimentin、E-cadherin 表达的影响。6.建立SW-13细胞裸鼠移植瘤模型,用随机数字表法设对照组、DMSO组,氯硝柳胺低浓度组、氯硝柳胺高浓度组。经腹腔注药,动态监测瘤体直径、瘤重,观察氯硝柳胺作用裸鼠后对肿瘤体积和瘤重的影响,并计算生长抑制率。部分瘤体行HE染色,镜下观察组织形态。7.设顺铂组为阳性对照,各组裸鼠处死前通过眼眶内眦静脉采血,对血液样本进行血细胞、生化分析。8.采用TUNEL法检测氯硝柳胺作用裸鼠后对移植瘤组织细胞凋亡率的影响。9.采用免疫组织化学染色法检测氯硝柳胺作用裸鼠后对移植瘤组织中β-catenin、LRP6、vimentin、E-cadherin、Bc 1-2,caspase-3 表达的影响。结果:1.不同浓度的氯硝柳胺分别作用SW-13细胞24、48、72、96、120h后,呈时间和浓度依赖性抑制SW-13细胞增殖(F=157.93,P<0.001)。2.流式细胞仪细胞周期检测结果显示24、48、72h后,与对照组相比氯硝柳胺组将SW-13 细胞周期阻滞在 G0/G1 期(P=0.001、0.005、0.008)。3.AO/EB染色法和Annexin V/PI染色法结果均显示氯硝柳胺组的凋亡率高于照组(均 P<0.001)。4.Transwell实验结果示氯硝柳胺组SW-13细胞的侵袭力低于对照组(P<0.001),细胞划痕实验结果显示氯硝柳胺组SW-13细胞的迁移能力低于对照组(P=0.002)。5.Western Blotting 结果示氯硝柳胺组 SW-13 细胞 β-catenin、LRP6、vimentin 的表达低于对照组(均P<0.001),而E-cadherin的表达高于对照组(P=0.004)。6.HE染色组织切片证实成功建立SW-13细胞裸鼠移植瘤模型,氯硝柳胺低浓度组、氯硝柳胺高浓度组的终末肿瘤体积和瘤重,低于与对照组(均P<0.001),对照组与DMSO组差异无统计学意义(均P>0.05)。7.顺铂组的白细胞低于氯硝柳胺组、对照组(均P<0.001),氯硝柳胺组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。氯硝柳胺组、顺铂组的红细胞和血小板与对照组之间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。顺铂组的尿素氮、肌酐、总胆红素、谷丙转氨酶均高于氯硝柳胺组、对照组(均P<0.001),氯硝柳胺组与对照之间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。8.移植瘤组织TUNEL检测结果示氯硝柳胺低浓度组、氯硝柳胺高浓度组的细胞凋亡率高于对照组(P=0.004,P=0.005)。9.移植瘤组织免疫组织化学染色结果显示氯硝柳胺低浓度组、氯硝柳胺高浓度组的β-catenin、LRP6、vimentin、Bcl-2 的表达低于对照组(均 P<0.001),E-cadherin、caspase-3的表达高于对照组(均P<0.001)。结论:1.氯硝柳胺呈时间-浓度依赖性抑制人肾上腺皮质癌SW-13细胞增殖,阻滞细胞周期,抑制侵袭力和迁移能力,促进细胞凋亡;抑制SW-13细胞裸鼠皮下移植瘤生长,其机制可能涉及Wnt/β-catenin信号通路,上皮间质转化(EMT)和凋亡相关蛋白表达异常。2.氯硝柳胺对血细胞、肝肾功能的影响小于顺铂。